星點設計-效應面法優(yōu)化飛揚草提取工藝研究

陶利，曹學成，周金輝

（1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，山東 濟南 250031；2.山東濟寧醫(yī)學院 藥學院，山東 濟寧 276826）

星點設計-效應面法優(yōu)化飛揚草提取工藝研究

陶利1，曹學成1，周金輝2Δ

（1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，山東 濟南 250031；2.山東濟寧醫(yī)學院 藥學院，山東 濟寧 276826）

目的利用星點-效應面設計法優(yōu)化飛揚草的最佳乙醇超聲提取工藝。方法以飛揚草中槲皮苷的含量為指標，選取乙醇濃度、提取時間、溶劑倍量3個因素進行考察，結(jié)合單因素實驗法和星點-效應面設計法對飛揚草的提取工藝進行優(yōu)化。結(jié)果飛揚草的最佳提取工藝為：乙醇濃度為60%，提取時間為50min，溶劑倍量為10，在此提取條件下平均提取量為2.39mg／g。結(jié)論采用本實驗方法優(yōu)化飛揚草的提取工藝，簡便合理。

飛揚草；響應面法；槲皮苷；超聲提取

1.2 含量測定方法的建立［6-7］

1.2.1 飛揚草的提取：將飛揚草藥材，去雜質(zhì)，置于烘箱中60℃干燥12 h，粉碎。各取10 g，精密稱定，將不同超聲時間（功率100W，頻率40 KHz）提取的飛揚草提取液濃縮，用提取時相應濃度的提取溶液定容至25m L，精密吸取1 mL，再用甲醇溶解并定容至10mL，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2 色譜條件［8］：色譜柱 Agilent TC-C18（4.6 mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈：0.1%磷酸水（25∶75）；檢測波長：256 nm；流速：1.0mL／min；柱溫：25℃；進樣量：20μL。

1.2.3 對照品溶液的制備：精密稱取槲皮苷對照品適量，加甲醇制得槲皮苷含量為0.05mg／mL對照品溶液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

1.2.4 線性關系考察：分別緊密吸取槲皮苷對照品溶液1、2、4、6、8、10mL，用甲醇稀釋成一系列的濃度溶液，按 2.1.1.項下方法測定峰面積，以槲皮苷的濃度（C）為橫坐標，峰面積積分值（S）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：S＝59820C＋672.9，R2＝0.9989，表明槲皮苷在5.0～50.0μg／mL的濃度范圍內(nèi)，與其色譜峰的峰面積的積分值線性關系良好。

2 結(jié)果

2.1 單因素考察

2.1.1 考察乙醇濃度對槲皮苷提取量的影響：精密稱取飛揚草各10g，分別用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇作為提取溶劑，以溶劑倍量為8，超聲提取30min，按1.2.1項下條件進行測定，考察乙醇濃度對槲皮苷提取量的影響，結(jié)果見圖1。由圖可知，隨著乙醇濃度的升高，飛揚草中槲皮苷的提取量逐漸增大，當乙醇濃度達到60%時，槲皮苷的提取量達到最大值，之后隨著乙醇濃度的增加，槲皮苷含量反而下降，其原因可能是槲皮苷是種極性高的黃酮類化合物，故60%為乙醇最佳濃度。

圖1 乙醇濃度對槲皮苷提取量的影響Fig.1 The effect of the ethanol concentration to the retrieval amount of quercitroside

2.1.2 考察提取時間對槲皮苷提取量的影響：精密稱取飛揚草各 10 g，以提取時間 30、40、50、60、70 min進行超聲提取，以溶劑倍量為8，乙醇濃度60%，按1.2.1項下條件進行測定，考察提取時間對槲皮苷提取量的影響，結(jié)果見圖2。研究結(jié)果表明，飛揚草中槲皮苷的提取量隨著提取時間的增加而升高，當提取時間為50min時，槲皮苷的提取量取得較大值，此后隨著時間的延長，提取量沒有顯著的變化，可能是因為槲皮苷的溶出已較為完全，故選擇50min為最佳提取時間。

圖2 提取時間對槲皮苷提取量的影響Fig.2 The effect of the extraction time to the retrieval amount of quercitroside

2.1.3 考察溶劑倍量對槲皮苷提取量的影響：精密稱取飛揚草各10 g，以溶劑倍量 6、8、10、12、14，以 60%乙醇為提取溶劑，超聲提取50min，按1.2.1項下條件進行測定，考察溶劑倍量對槲皮苷提取量的影響，結(jié)果見圖3。有圖可知，隨著溶劑倍量的增加，槲皮苷的提取量上升到一定程度后，增加量沒有顯著變化，故選定10為溶劑倍量。

圖3 溶劑倍量對槲皮苷提取量的影響Fig.3 The effect of the volume of solvent to the retrieval amount of quercitroside

2.2 星點設計-效應面法優(yōu)化提取工藝［9-10］在單因素實驗的基礎上，選擇對飛揚草提取效果影響較顯著的3個因素作為考察指標，即乙醇濃度（A），提取時間（B），溶劑倍量（C），以槲皮苷在不同提取中的含量為指標，采用三因素，三水平的Box-Behnken響應面優(yōu)化提取工藝［11-12］，見表 1、表 2。

表1 各因素水平的代碼值及實際物理量Tab.1 The code value of each factor level and the actual physical quantities

采用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，以槲皮苷含量對數(shù)據(jù)進行擬合得到回歸方程：Y＝2.38＋0.033A＋0.055B＋0.07C－0.02AB＋0.04BC－0.09B2－0.085C2，r＝0.9908，P＜0.0001；根據(jù)回歸方程可得，二次多項式擬合結(jié)果較好。方程回歸分析及方差分析結(jié)果見表3，并根據(jù)二次回歸方程繪制響應面曲線，能得到兩個因素交互作用對響應值Y的影響，結(jié)果見圖4。分析可知，各因素對槲皮苷提取量的影響由大到小依次為：溶劑倍量C＞提取時間B＞乙醇濃度A；在3個因素中，提取時間及溶劑倍量之間的交互作用對響應面的影響曲線較陡，等高線的數(shù)目也多于其他兩兩之間的交互作用，故提取時間和溶劑倍量對槲皮苷的提取量具有非常顯著的影響（P＜0.01）。

2.3 最佳處方的驗證 采用Design-Expert V8.0.6軟件分析數(shù)據(jù)，得到飛揚草中槲皮苷提取的理論最佳工藝條件為：乙醇濃度為61.1%，提取時間為51.9min，溶劑倍量為10.3。在此條件下預測槲皮苷的提取量為2.45mg／g。根據(jù)實際試驗操作，按乙醇濃度60%，提取時間50min，溶劑倍量10，對飛揚草進行3次平行驗證試驗，測得槲皮苷的平均提取量為2.39 mg／g。結(jié)果表明，試驗優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準確可靠。

表3 回歸系數(shù)顯著性分析Tab.3 Analysis of significance of regression coefficient

圖4 槲皮苷含量對乙醇濃度（A）、提取時間（B）及溶劑倍量（C）的三維效應面圖Fig.4 The 3D effect graph of the quercitroside content to the ethanol concentration（A），the extraction time（B）and the volume of solvent（C）

3 討論

本文先通過單因素實驗，考察了乙醇濃度、提取時間、溶劑倍量對槲皮苷的提取量的影響，再進一步用星點-效應面設計法優(yōu)選對槲皮苷提取量影響較大的3個因素乙醇濃度和提取時間和溶劑倍量［13-14］，結(jié)合實驗具體操作得到最佳超聲提取時間為：乙醇濃度為60%，提取時間為50min，溶劑倍量為10，提取效果較好，為飛揚草的批量提取及進一步研制飛揚草的相關劑型提供參考。相較傳統(tǒng)煎煮法，本研究采用超聲波提取法，具有時間短、效率高的特點，可以有效避免溫度過高造成的有效成分損失。而乙醇對有效成分槲皮苷有較好的溶解度，醇提物雜質(zhì)相對較少。飛揚草為民族中藥材，具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛作用，相關報道還較少?；瘜W成分表明，飛揚草中主要成分為黃酮苷、酚類和三萜等［15］。同時藥理研究表明，飛揚草總黃酮對急性炎癥有明顯的抑制作用，具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用［16］。依據(jù)藥典中對飛揚草的含量測定方法，選用有效成分槲皮苷作為評價指標進行實驗。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：46.

［2］ 宋龍，徐宏喜，楊莉，等.飛揚草的化學成分與藥理活性研究概況［J］.中藥材，2012，35（6）：1003-1009.

［3］ 章佩芬，羅煥敏.飛揚草藥理作用研究概況［J］.中藥材，2005，28（5）：437-438.

［4］ 楊梅.飛揚草的應用［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2006（2）：121-122.

［5］ 南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典［M］.第二版（上冊）.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，2005：179.

［6］ 曾勇，胡筱梅，瞿京紅.反相高效液相色譜法同時測定飛揚草中楊梅苷和槲皮苷含量的方法探討［J］.國際中醫(yī)中藥雜志，2013，35（1）：46-48.

［7］ 鐘保恒.HPLC測定飛揚草中槲皮苷的含量［J］.中國現(xiàn)代中藥，2009，11（8）：32-34.

［8］ 馬春婷，伍思強.高效液相色譜法測定飛揚草中槲皮苷的含量［J］.今日藥學，2009，19（10）：26-28.

［9］ 江興龍，賈運濤，張良珂等.星點設計-效應面法優(yōu)化葛根素自微乳化釋藥系統(tǒng)［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2012，14：1416.

［10］ 蔡恩博，張崇禧，朱啟光，等.星點設計-效應面法優(yōu)選暴馬丁香樹皮中紫丁香苷的提取工藝［J］.藥物分析雜志，2011，31（9）：1808-1811.

［11］ 吳云娟，沙先誼，李珺嬋，等.星點設計-效應面優(yōu)化法優(yōu)化三七總皂苷鼻腔用粉霧劑［J］.中成藥，2005，27（1）：10-15.

［12］ 熊萍，張榕文，萬玉華，等.超聲-微波協(xié)同萃取法提取飛揚草中沒食子酸的工藝研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2011，13（6）：45-47.

［13］ 黃勇紅，黃艷萍，陳任宏.飛揚草藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（16）：74-76.

［14］ 藍曉玉，鐘保恒.HPLC同時測定飛揚草中沒食子酸和槲皮苷的含量［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2011，28（7）：671-673.

［15］ 陳玲.飛揚草葉中的多酚類成分研究［J］.中國中藥雜志，1991，18（1）：38-39.

［16］ 陳任宏，黃艷萍，唐省三，等.飛揚草化學成分及藥理作用的研究進展［J］.今日藥學，2011，21（7）：393-395.

（編校：李璐璐）

Studies on optim izing extraction technology of Euphorbia hirta L.by central com posite design-response surfacemethodology

TAO Li，CAO Xue-cheng，ZHOU Jin-hui

（1.Department of Pharmacy，Jinan Military General Hospital，Jinan 250031，China；2.School of Medicine，Jining Medical University，Jining 276826，China）

ObjectiveTo optimize the extraction process of Euphorbia hirta L.by Central composite design／response surface methodology with ethanol by the ultrasonic extraction technology.MethodsBased on the single factor experiment and central composite design-response surface methodology，the content of quercitroside was regarded as evaluation index，select ethanol concentration，extraction time，and solid-liquid ratio as three evaluation factors to achieve the purpose.ResultsThe results indicated that the optimal extraction processwas obtained as follows：10 times the amount of60%ethanol under ultrasound for 2 times，50min each；the average content of the quercitrosidewas2.39mg／g.ConclusionThemethod to optimize the extraction process is simple and reasonable.

Euphorbia hirta L.；central composite design-response surface thodology；Quercitroside；ultrasonic extraction

R932

A

1005－1678（2014）04－0161－03

飛揚草是大戟科植物飛揚草Euphorbia hirta L.的干燥全草。飛揚草具有清熱解毒，利濕止癢，通乳的功效。用于肺癰，乳癰，疔瘡腫毒，牙疳，痢疾，泄瀉，熱淋，血尿，濕疹，腳癬，皮膚瘙癢，產(chǎn)后少乳等癥［1］?；瘜W成分研究表明，其主要成分為黃酮苷、酚類和三萜等［2］。藥理研究表明，飛揚草總黃酮具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，對急性炎癥有抑制作用［3］。據(jù)文獻報道及2010版中國藥典，本研究選擇黃酮類成分中的有效成分槲皮苷進行定量研究［4-5］，采用星點設計-效應面法擬合數(shù)據(jù)模型，優(yōu)化飛揚草中槲皮苷的提取工藝，以便為進一步的制劑開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent1100型高效液相色譜儀；VWD檢測器；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；DZKW-C型電子恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；槲皮苷對照品由中國藥品生物鑒定所鑒定（批號：111538-201402）；飛揚草藥材（購自成都市荷花池中藥材市場）經(jīng)濟南市食品藥品監(jiān)督管理局鑒定為合格藥材；乙腈（色譜純，天津四友）；超純水自制；其他試劑均為分析純。

全軍“十一五”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（6J-006）

陶利，女，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥學，郵箱：694831261＠qq.com；周金輝，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：藥物分析，郵箱：2332294065＠qq.com。