3，5-二氨基苯甲酸縮鄰香草醛席夫堿鎘配合物的合成及抗腫瘤活性研究

張 震

(濟寧醫(yī)學院藥學院，山東 日照 276826)

席夫堿及其配合物的特殊生理活性，使其在抑菌、抗腫瘤等方面表現(xiàn)獨特的藥理活性[1-2]。席夫堿配合物的藥用性引起人們的廣泛關注，對其藥理作用的研究也進一步加深。近年來，研究表明許多席夫堿銅配合物具有良好的蛋白酶體抑制作用，從而選擇性誘導腫瘤細胞凋亡[3-4]。本實驗以3，5-二氨基苯甲酸和鄰香草醛為原料合成了席夫堿配體，進而合成了其鎘配合物，對其進行了結構表征。在細胞水平上，通過細胞增殖分析，蛋白酶體活性抑制作用分析，免疫蛋白印跡分析和細胞形態(tài)分析，研究了配合物的抗腫瘤活性和對正常細胞的毒性。以期在此研究基礎上，為設計、合成低毒、高效且選擇性高的新型抗腫瘤藥物提供重要的理論依據。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

3，5-二氨基苯甲酸、鄰香草醛和醋酸鎘(阿拉丁試劑有限公司)；DMSO和溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑)(MTT)(Sigma-Aldrich公司)；DMEM/F12 (1∶1)、青霉素、鏈霉素(Invitrogen 公司)；胎牛血清 (FBS)(Aleken Biologicals公司)；熒光底物 Suc-LLVY-AMC (Calbiochem 公司)；單克隆抗體(PARP) 、ubiquitin (P4D1) 、IκB-α (H-4)、 β-actin (C-11) 和第二抗體(Santa Cruz 公司)。Perkin-Elmer 240C型 元素分析儀；Nicolet 170SX 型紅外光譜儀(KBr 壓片)；AVANCE III (600 MHz)超導核磁共振波譜儀；DDS-312 型電導率儀。

1.2 席夫堿配體(L)的合成

將2.0 mmol的3，5-二氨基苯甲酸，用10ml乙醇溶解后，不斷攪拌下，滴入到4 mmol的鄰香草醛無水乙醇溶液中，逐漸有橘黃色沉淀產生，50 ℃反應2 h，室溫下冷卻，過濾，用無水乙醇多次洗滌沉淀，得到橘黃色席夫堿配體L，呈粉末狀。收率80%。元素分析(C7H4N2O2) (C8H6O2)2計算值(%)：C，66.02；H，4.34；N，6.69。實測值：C，65.95；H，4.41；N，6.63。

1.3 配合物CdL的合成

用20ml甲醇加熱溶解希夫堿配體，逐滴加入含等摩爾的醋酸鎘的甲醇溶液，60 ～70 ℃回流7 h。過濾，沉淀用冷的甲醇洗滌多次得到鎘配合物CdL，收率73%。元素分析[Cd(C7H4N2O2) (C8H6O2)2]·2H2O計算值(%)：C，48.91；H，3.57；N，4.96；Cd，19.90。實測值：C，48.35；H，3.83；N，5.27，Cd，19.81。

1.4 配合物的抗腫瘤活性試驗

本研究所用細胞為人乳腺癌MDA-MB-231細胞和人乳腺MCF-10A 細胞(永生，非致瘤性)。

用MTT法測定配合物對腫瘤細胞增殖的抑制作用；用Wallac Victor 3多標記讀數(shù)器測定水解AMC基團的量；用Bradford 蛋白分析儀測定細胞裂解液的蛋白濃度；用特定的抗體 IκB-α，PARP 和 β-actin進行Western blot 分析；使用Zeiss Axiovert 25顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜分析

配合物的紅外光譜數(shù)據列于表1中。

表1 配合物的主要紅外光譜數(shù)據 (cm-1)

從表1中紅外光譜數(shù)據可知，配體在3563.94cm-1處存在羥基吸收峰，而在配合物中，這一吸收峰消失，說明配體羥基中的氧原子參與配位，與金屬離子形成配位鍵。在1615.46 cm-1的處存在COOH吸收峰，并且沒有發(fā)生明顯偏移，說明配體COOH上的O原子并沒有參與配位。在493.27 cm-1和 415.04cm-1處，分別出現(xiàn)兩處新峰，可歸為Cd-O和Cd-N的伸縮振動峰。

2.2 配合物的1H NMR數(shù)據

CdL：[Cd(C7H4N2O2) (C8H6O2)2]·2H2O，1H NMR (DMSO，600MHz)：δ (ppm) 12.772 (1H，s，COOH)；9.347 (2H，s，CH=N)；6.392-7.855 (6H，m，Ar-H)；3.911 (6H，s，OCH3)。

根據CdL的1H NMR 數(shù)據可知，在12.772 ppm 處的單峰為COOH 基團上的H，在9.347 ppm處的單峰為甲亞胺 (-CH=N-)上的H，在6.392～7.855 ppm范圍歸為芳香環(huán)上H。在3.911 ppm 處強的單峰歸為-OCH3上的質子。酚羥基上的H原子峰消失，說明被金屬離子取代。

2.3 配合物的熱重分析

在25～800℃溫度范圍內，配合物主要分兩步進行熱分解，第一步熱分解的溫度區(qū)間為25～125 ℃，失重率為3.28%，與失去相應分子結晶水比較相符(計算值為 3.19%)。配合物的殘重率為23.11%與相應金屬氧化物CdO的理論的殘重率接近(計算值為22.73%)。

2.4 配合物的摩爾電導率

配合物的摩爾電導率如表2所示。

配合物易溶于DMF和DMSO，配合物溶于DMSO的摩爾電導率為11.61S·cm2·mol-1，小于35 S·cm2·mol-1，可認為配合物為非電解質。

2.5 配合物CdL的可能的結構

圖1 配合物的可能結構

2.6 抗腫瘤活性研究

2.6.1不同濃度的CdL對人類乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響 濃度為5、10、20、40、80μM的CdL以及相應體積溶劑DMSO處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231 24 h，結果如圖2所示。

圖2 不同濃度的CdL對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用

由圖2可知，與陰性對照DMSO處理相比，當濃度為20 μM 時，CdL對MDA-MB-231細胞增殖有明顯的抑制作用，抑制率為43%。濃度達到40 μM 和80 μM，抑制率分別約為80%和98%，說明CdL抑制人乳腺癌細胞增殖活性隨濃度增加而梯度增強，呈濃度依賴關系。

2.6.2不同濃度的CdL對純化的20S蛋白酶體的CT活性的抑制作用 為了考察CdL抑制蛋白酶體活性是否與抑制細胞增殖活性相似，同樣條件下，濃度1、5、10、20、40 μM的配合物CdL和相應體積溶劑(DMSO)作為陰性對照，處理純化的人20 S蛋白酶體，37 ℃孵育2 h，測定其類糜蛋白活性的抑制作用。結果如圖3所示。

圖3 不同濃度CdL對純化的20S 蛋白酶體中類糜蛋白活性的抑制作用

由圖3可知，配合物CdL具有較強的抑制純化的20S蛋白酶體CT活性作用，依賴濃度的方式增加，抑制活性不斷增強，其IC50值為3.3 μM。

2.6.3CdL對人乳腺癌MDA-MB-231細胞蛋白酶體抑制作用及細胞凋亡誘導作用 實驗已經證明，CdL能夠抑制腫瘤細胞增殖，抑制蛋白酶體的活性。為考察腫瘤細胞凋亡是否由蛋白酶體CT活性受抑制引起的，濃度20 μM 的CdL處理乳腺癌MDA-MB-231細胞2、4、8、12 h，收集細胞，測定其蛋白酶體的活性，免疫蛋白印跡分析以及細胞形態(tài)分析。結果如圖4 所示。

由圖4可知,CdL處理MDA-MB-231細胞4 h后,已經出現(xiàn)較為明顯的蛋白酶體CT活性抑制,其抑制率達28%(圖A),相應的泛素蛋白表達也開始累積,蛋白酶體的靶向蛋白IκB-α積累出現(xiàn)在處理細胞8 h(圖B)。隨著處理時間的增長,抑制蛋白酶體CT 活性的作用增強,泛素蛋白的表達以及蛋白酶體靶向蛋白也不斷累積。同一實驗中,由圖4C可知,腫瘤細胞形態(tài)學變化(細胞變圓、脫壁現(xiàn)象)出現(xiàn)在CdL處理細胞8 h,12 h后出現(xiàn)大量腫瘤細胞凋亡現(xiàn)象。細胞凋亡相關蛋白PARP的p85 KD蛋白片斷出現(xiàn)在8 h(圖4B)。由此可以得出,蛋白酶體活性的抑制先于腫瘤細胞凋亡,CdL以時間依賴方式抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231蛋白酶體的活性進而誘導其凋亡。

2.6.4CdL對人類乳腺正常細胞MCF-10A的細胞毒性 新型抗癌藥物的開發(fā)應具備對正常細胞的毒性較小甚至無毒性。為了考察CdL對正常細胞的毒性,濃度為20 μM的CdL(DSF,CdCl2,DSF-Cd和 DMSO作對照,有研究表明DSF-Cd有較強的抑制蛋白酶體活性和誘導腫瘤細胞凋亡能力[5])分別處理乳腺癌MDA-MB-231細胞和正常乳腺MCF-10A 細胞24 h。之后進行了細胞增殖抑制分析(圖5A)和細胞形態(tài)分析(圖5B)。

細胞增殖分析(A)；細胞形態(tài)變化(B)

圖5 CdL對人乳腺癌細胞和人正常乳腺細胞的不同作用

由圖5可知，CdL對MCF-10A細胞的增殖僅有微弱的抑制作用，抑制率不到5%，而對乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞增殖抑制顯著的不同，同等條件下，其抑制率為54%(圖5)，因此，乳腺癌MDA-MB-231細胞比正常MCF-10A 細胞對CdL有更高的敏感性。DSF 和 CdCl2對這兩種細胞系抑制作用均較小。然而，DSF-Cd 混合物對MDA-MB-231的抑制率約為90%，但其對MCF-10A也有較強毒性(其抑制率為42%)。結果表明，CdL比已報道的DSF-Cd混合物更具有臨床前研究價值。

3 結論

本研究合成了席夫堿配體L和配合物CdL,通過結構表征，得到了配合物的準確結構。將所得配合物作用于人乳腺癌MDA-MB-231細胞，結果顯示CdL具有較強的抑制MDA-MB-231細胞增殖能力，配合物通過抑制腫瘤細胞內蛋白酶體CT活性進而誘導腫瘤細胞凋亡，且對正常細胞的毒性較小。本研究表明，在新型的抗癌治療中，3，5-二氨基苯甲酸縮鄰香草醛席夫堿鎘配合物可以作為潛在的蛋白酶體抑制劑和腫瘤細胞凋亡的誘導劑，然而，還需要進一步的生物學分析和臨床前試驗。

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