大黃酸對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞中HER-2蛋白表達(dá)的影響

陳 海 戚曉東 邱 萍

乳腺癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患者的身心健康甚至是生命。原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER-2)是1種原癌基因，在多種上皮源性腫瘤具有異常擴(kuò)增以及過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，證實(shí)HER-2在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中具有重要意義[1]。大黃酸(Rhein)是傳統(tǒng)中藥大黃有效成分中大黃蒽醌類化合物的一種，目前已有大量研究資料表明，其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、預(yù)防腎小球硬化、抗炎、治療糖尿病深度以及保護(hù)肝抗纖維化等作用[2]。本研究擬用大黃酸干預(yù)人乳腺癌腫瘤細(xì)胞，并觀察其對(duì)HER-2蛋白表達(dá)的影響，旨在為臨床應(yīng)用大黃酸治療乳腺癌的提供實(shí)驗(yàn)以及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌SK-Br-3細(xì)胞株選自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。大黃酸選自天津藥品檢驗(yàn)所，純度在98%以上。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM選自Gibco公司；胎牛血清均選自中科院醫(yī)學(xué)生物工程研究所TBD公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)、明膠以及Ⅰ型膠原酶均選自Sigma公司。抗HER-2單克隆抗體選自NeoMarkers公司。DNAThennal Cycler型PCR擴(kuò)增儀(Perkin Elmer公司)，DU800型核酸/蛋白分析儀(Beckman公司)，Galaxy B型CO2培養(yǎng)箱(RS Biotech公司)，Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(Thenno Labsystenls公司)，Pharmacia KB Multiple Ⅱ蛋白電泳系統(tǒng)(Pharmacia公司),LX-70型倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SK-Br-3細(xì)胞株置于無(wú)菌離心管之中，加入3 ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，然后在室溫下于1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心分離10 min，棄去上清液，然后加入15%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃及含5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d進(jìn)行1次傳代，1瓶細(xì)胞可獲得傳代2瓶。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 經(jīng)培養(yǎng)的SK-Br-3細(xì)胞株按照4×103個(gè)細(xì)胞/孔將其接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)良好以后，加入不同濃度(0、20、40和80 μmol/L)的大黃酸，繼續(xù)培養(yǎng)0 h、24 h、48 h以及72 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。吸出上清液，然后加入20 μl 0.5 g/L的MTT，置于37 ℃下含有5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再次吸出上清液，再加入200 μl DMSO，充分振蕩結(jié)晶以后應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置無(wú)藥對(duì)照孔以及無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔，每組均設(shè)置3孔平行樣。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-藥物組A/對(duì)照組A)×100%。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取以及Western blot檢測(cè) 對(duì)分別應(yīng)用20、40和80 μmol/L的大黃酸處理48 h以及未加藥物處理的SK-Br-3細(xì)胞，采用預(yù)冷1×PBS洗滌3遍，然后加入100 ml新制細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-Hcl+150 mmol/L NaCl+1% NP-40+1 mmol/L NaF+1 mmol/L Na3VO4+10 g/L 亮抑酶肽+1% 抑蛋白酶肽+1 mmol/L 苯甲基磺酰氟)，將裂解液與細(xì)胞充分混勻，置于冰浴下處理20 min，然后在4℃轉(zhuǎn)速為13 000 r/min下離心分離15 min。取上清液置于微量離心管中，采用BCA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，并調(diào)整各標(biāo)本中的蛋白含量一致。按照測(cè)定的濃度進(jìn)行蛋白上樣量調(diào)整，加入1/4體積(6 μL)5×上樣緩沖液，予以煮沸變性處理5 min，然后應(yīng)用10% SDS-PAGE膠電泳。完成電泳后，將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜致傷，應(yīng)用1%的BSA進(jìn)行封閉處理1 h，應(yīng)用一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后再加入相應(yīng)的二抗孵育處理2 h。將化學(xué)發(fā)光劑滴至膜上，操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。拍攝凝膠成像并分析條帶灰度值。以條帶與β-actin灰度值之比作為其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 RNA提取及PCR測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞接種在6孔板上，分別加入不同濃度大黃酸(0、20、40和80 μmol/L)處理0、24、48、72 h，提取細(xì)胞中的總RNA，并測(cè)定吸光度。采用兩步法PT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增處理，檢測(cè)HER-2 mRNA表達(dá)情況。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃腺癌變性處理30 s，57 ℃復(fù)性處理30 s，72 ℃延伸處理30 s，重復(fù)30次。引物片段：HER-2的上游引物為5′-ACA CTG ATA GAC ACC AAC CGC TC-3′，長(zhǎng)度為379 bp，下游引物為5′-CGT CGT AGA AAG GTA GTAGTAGG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大黃酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

作用時(shí)間相同，隨著大黃酸濃度的增高，細(xì)胞抑制率呈顯著上升趨勢(shì)；大黃酸濃度相同情況下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞抑制率顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 大黃酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

注：a為與對(duì)照組比較，P<0.05；b為與作用24 h比較，P<0.05；c為與作用48 h比較，P<0.05。

2.2 不同濃度大黃酸對(duì)乳腺癌中HER-2表達(dá)的影響

經(jīng)濃度分別為0、20、40和80 μmol/L的大黃酸干預(yù)處理48 h后，檢測(cè)細(xì)胞中HER-2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，對(duì)照組呈高表達(dá)，而藥物組HER-2表達(dá)隨著大黃酸濃度的增高而下降，見(jiàn)表2。

2.3 大黃酸作用不同時(shí)間對(duì)乳腺癌細(xì)胞中HER-2蛋白表達(dá)的影響

40 μmol/L大黃酸處理0 h、2 h、48 h以及72 h后檢測(cè)HER-2 mRNA及蛋白表達(dá)情況。對(duì)照組HER-2呈高表達(dá)，經(jīng)大黃酸處理后，HER-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低，且隨著藥物作用時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，HER-2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)表3。

表2 不同濃度大黃酸對(duì)乳腺癌細(xì)胞中HER-2表達(dá)的影響

注：a為與對(duì)照組比較，P<0.05；b為與20 μmol/L比較，P<0.05；c為與 40 μmol/L比較，P<0.05。

表3 大黃酸作用不同時(shí)間對(duì)乳腺癌細(xì)胞中HER-2蛋白表達(dá)的影響

注：a為與對(duì)照組比較，P<0.05；b為與作用24 h比較，P<0.05；c為與作用48 h比較，P<0.05。

3 討論

近年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及各類化療藥物的問(wèn)世，乳腺癌的臨床療效獲得了一定程度的改善，但由于手術(shù)創(chuàng)傷、化療副作用等，總體有效率仍較低。故尋找1種新的合理有效的化療藥物治療乳腺癌，提高臨床療效、改善患者的生存質(zhì)量尤為迫切。

大黃酸是中藥大黃的主要活性成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒以及抗腫瘤等多種藥理活性，特別是其抗腫瘤作用機(jī)制受到了廣泛關(guān)注。相關(guān)研究資料證實(shí)，大黃酸對(duì)于多種惡性腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，例肺癌、結(jié)腸腺癌、舌癌、卵巢癌以及鼻咽癌等[3]。此外，大黃酸聯(lián)合MMC能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞中核苷的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而起到抗癌的作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用不同濃度的大黃酸處理乳腺癌SK-Br-3細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用。例如在相同作用時(shí)間下，不同濃度大黃酸對(duì)SK-Br-3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率隨濃度的增加而增加，存在劑量依賴性；而在相同濃度下應(yīng)用大黃酸對(duì)SK-Br-3細(xì)胞處理24 h、48 h和72 h后，SK-Br-3細(xì)胞的抑制率也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。認(rèn)為大黃酸能夠有效抑制人乳腺癌SK-Br-3的增殖，并且具有時(shí)間-劑量依賴性。

HER-2屬于1種腫瘤表面抗原，臨床研究表明，約有20%～80%左右的晚期乳腺癌患者具有HER-2過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，這類患者不僅病情發(fā)展迅速，且對(duì)于傳統(tǒng)化療藥物具有明顯的耐藥性，極易發(fā)生化療失敗，臨床預(yù)后較差，治療后復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移率較高[5]。大部分學(xué)者認(rèn)為HER-2的擴(kuò)增以及過(guò)表達(dá)現(xiàn)象與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及惡性生物學(xué)行為具有密切關(guān)系。李慧慧等[6]應(yīng)用熒光原位雜交法對(duì)328例乳腺癌患者的石蠟標(biāo)本進(jìn)行HER-2基因擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果顯示，HER-2表達(dá)陽(yáng)性率為26.2%，且HER-2表達(dá)與乳腺癌臨床分級(jí)、病理類型、腫瘤直徑以及腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)均具有顯著相關(guān)性。Duchnowska[7]認(rèn)為，HER-2表達(dá)水平越高，晚期乳腺癌腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)也將隨之增加。本研究亦顯示，在人乳腺癌腫瘤細(xì)胞SK-Br-3中，HER-2蛋白以及mRNA均呈現(xiàn)高表達(dá)，與相關(guān)報(bào)道的基本一致。故認(rèn)為以HER-2為乳腺癌治療靶點(diǎn)，通過(guò)封閉HER-2蛋白的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。

林雅軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸能夠抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞系MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231以及SK-Br-3細(xì)胞EGFR以及HER-2蛋白以及mRNA表達(dá)水平，且呈現(xiàn)劑量依賴性。本研究亦顯示，應(yīng)用大黃酸處理SK-Br-3細(xì)胞后，HER-2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)以及作用濃度的增加而降低。提示大黃酸能夠下調(diào)SK-Br-3 mRNA及蛋白表達(dá)，從而起到抑制瘤細(xì)胞增殖的作用。細(xì)胞增殖抑制作用檢測(cè)亦顯示，在相同的作用時(shí)間下，大黃酸濃度為20、40和80 μmol/L時(shí)，細(xì)胞抑制率呈顯著上升趨勢(shì)；在相同濃度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率顯著升高。認(rèn)為大黃酸能夠通過(guò)干預(yù)SK-Br-3細(xì)胞的HER-2信號(hào)分子表達(dá)，從而起到降低腫瘤的惡性表型，抑制癌細(xì)胞增殖的作用，可作為乳腺癌治療的新途徑[9]。Lin等[10]認(rèn)為，大黃酸能夠利用線粒體以及Caspase通路而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因大黃酸能夠提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子以及活性氧自由基的聚集，降低線粒體的膜電位，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，抑制HER-2蛋白及mRNA表達(dá)是大黃酸誘導(dǎo)人乳腺癌SK-Br-3細(xì)胞凋亡的主要通路。

綜上所述，HER-2高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，而大黃酸能夠下調(diào)人乳腺癌SK-Br-3的蛋白及mRNA表達(dá)，有效抑制人乳腺癌SK-Br-3細(xì)胞的增殖，并且具有時(shí)間-劑量依賴性，可作為乳腺癌治療的新途徑。

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