蒲公英根多糖的抗氧化活性研究

葛明明，繆月英，孫麗娜，李國清，胡 北，高金波

（1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯154007；2.黑河學院物理化學系，黑龍江 黑河164300；3.哈爾濱學院，黑龍江 哈爾濱150017）

蒲公英屬菊科多年生草本植物，蒲公英植物體內(nèi)含有胡蘿卜素類［1］、三萜類［2］、植物甾醇類、酚酸類、黃酮類［3］、等多種成 分［4～6］，有 抗 腫 瘤［7］、免 疫［8］、抗 菌［9］、抗 氧 化［10］、利膽［11］等功效。還可生吃、炒食、做湯。在生命活動中，由于氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生多種自由基，這些自由基一方面是生物體多種生理功能的啟動因素和生化反應的介導者，另一方面也在免疫細胞因子網(wǎng)絡中起調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導等作用［12］。隨著年齡的增長，自由基的自穩(wěn)態(tài)平衡作用在機體內(nèi)不斷下降，從而導致生命自身免疫功能的下降，這一下降可導致機體發(fā)生惡性腫瘤、原發(fā)性高血壓、動脈粥樣硬化、Alzheimer型早老性癡呆、糖尿病等自由基疾?。?3］。有研究表明：從各種生物體內(nèi)提取的多糖物質(zhì)均具有提高機體免疫力、可抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲、還能延緩衰老等一系列作用，在食品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域得到廣泛應用［14，15］，因為蒲公英根中富含多糖［16］。所以本實驗經(jīng)摸索后以超聲波協(xié)同酶法從蒲公英根中提取多糖，并在研究了多糖的提取工藝、結(jié)構(gòu)、單糖組成分析的基礎上［17，18］，對其多糖進行抗氧化活性測定，以期待對蒲公英的進一步的應用開發(fā)等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英根夠置于河北省安國市京華藥業(yè)有限公司，經(jīng)由佳木斯大學生藥學教研室教授劉娟鑒定為蒲公英根；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH自由基）美國Sigma公司；抗壞血酸（Vc）、番紅花紅T、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、硫酸亞鐵、30%過氧化氫等均為國產(chǎn)分析純，甲醇。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（配有自動進樣器，可變波長紫外檢測器和REV.A.06.03色譜工作站）美國安捷倫公司；UV 757型紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；TGL-10B高速臺式離心機。

1.3 工作曲線的繪制

分別吸取濃度為0.5mg／m L的葡萄糖標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L，以蒸餾水稀釋至50m L的容量瓶中。各精密吸取1.0mL置干凈的試管中，各管加入5%的苯酚1m L，混勻，迅速加入濃硫酸7.00m L，搖勻，靜置5min后，放入85℃水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫，在490nm處測定吸光度，并以濃度（C：μg／m L）為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，計算相關(guān)系數(shù)。

1.4 多糖的提取及含量測定

1.4.1 蒲公英根中多糖的提取

蒲公英根→粉碎→過篩→石油醚、95%的乙醇回流脫脂、脫低聚糖→50℃熱風干燥→稱取適量的蒲公英根+提取液（料液比=1：40）+纖維素酶，在一定的溫度下，超聲波提取→濃縮至總體積的1／3→Sevage法除去游離蛋白→大孔吸附樹脂脫色→終濃度為75%的乙醇沉淀→重蒸餾水重新溶解→終濃度為75%乙醇沉淀→低溫干燥→蒲公英根多糖→過Sephadex-75柱精制。

1.4.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法［19］進行多糖的含量測定。

1.5 羥基自由基的生成和清除率的測定

利用Fenton反應體系［20］，檢測多糖提取物對羥基自由基清除作用。取0.15mol／L的磷酸緩沖溶液（p H=7.4）1.00m L，0.262mg／m L番紅花紅 T 溶液0.20m L，6mmol／L的EDTA-Na+Fe2+1.00m L，然后分別加入7.00m L不同質(zhì)量濃度 （0.02mg／mL，0.04mg／m L，0.06mg／mL，0.08mg／mL，0.1mg／mL）的多糖，后加入0.8mL的3%的過氧化氫，放入40℃水浴30min后，在520nm處的測吸光度值。配制相同濃度的VC溶液，根據(jù)以上實驗方法，進行實驗。其清除率可用下式計算：

式中：A1—體系中未加樣品溶液時的吸光度；AS—體系中加了樣品溶液時的吸光度；A2—番紅花紅和緩沖溶液混合后的吸光度。

1.6 超氧陰離子自由基的生成和清除率的測定

加入3.00m L的Tris-HC1緩沖溶液（p H=8.2）和0.10m L不同濃度的樣品溶液，25℃水浴20min，加入濃度為7mmol／L的鄰苯三酚溶液3.00m L，反應4min，再加入10mol／L的HCl終止反應，以蒸餾水作參比，在420nm處測吸光度值，同時以VC作對照。其清除率可用下列公式計算：

式中：A1—為樣品加入緩沖溶液及鄰苯三酚后的吸光度；A2—樣品加入緩沖溶液后的吸光度；A0為緩沖溶液加入鄰苯三酚后的吸光度。

1.7 HPLC法測定DPPH·自由基的生成與清除率

1.7.1 色譜條件

色 譜 柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm ×4.6mmi.d.；流動相：甲醇∶水=80∶20；柱溫：25℃；流速：1.0mL·min-1，檢測波長517nm。

1.7.2 HPLC法測定清除DPPH·自由基

取多糖試樣液2.00m L及DPPH乙醇溶液2.00m L濃度為2×10-4mol／L，先后加入同一具塞試管中，同時做空白實驗等，置于37℃是恒溫水浴中，30min后分別測定DPPH的色譜峰面積；以VC作對照，其清除率可用下列公式計算：

式中：A0—2.00mL DPPH+2mL蒸餾水時測定DPPH的色譜峰面積；A1—2mL DPPH+2mL多糖溶液時測定DP-PH的色譜峰面積；A2—2m L多糖溶液+2m L乙醇時測定DPPH的色譜峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英多糖提取的正交實驗設計及實驗結(jié)果

本實驗是在單因素考察的基礎上進行的［17］，以料液比1：40為固定條件，按照正交實驗設計對影響超聲波纖維素酶法提取蒲公英多糖的因素，如：提取溫度（45℃、50℃、55℃）、p H（4.5、5、5.5）、加酶量（占底物%：1%、2%、3%）、提取時間（15min、20min、25min）等，進行條件正交試驗優(yōu)化，平行3次所得結(jié)果見表1。

表1 正交試驗設計L9（34）及實驗結(jié)果（n=3）

由實驗所得的數(shù)據(jù)分析可知，影響蒲公英多糖提取率的主次關(guān)系：影響最大的是提取時間的多少，其次是提取溫度的大小，然后是p H值的大小，影響最小的是提取時所加的纖維素酶的量。結(jié)果正交實驗所獲得的最佳工藝條件為：取時間為25min，提取溫度50℃，p H值為5.0，酶量為底物的3%，多糖的提取率為：15.83%。

2.2 多糖含量測定的工作方程與含量

以葡萄糖為對照品，波長490nm處測得吸光度（A）與葡萄糖質(zhì)量濃度 （ρ）之間的回歸方程為：A=0.006ρ+0.0239，r=0.9995，線性范圍是10.0～100μg／m L，提取物中的多糖含量為83.31%。

2.3 蒲公英多糖質(zhì)量濃度對清除·OH的影響

見圖1。

圖1 蒲公英根多糖質(zhì)量濃度對·OH清除率的影響（n=3）

由圖1可知，蒲公英多糖清除·OH的作用在0～0.1mg／mL范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，清除率逐漸升高；與VC的清除率比較分析，雖低于VC，但清除·OH的作用仍然較強。

2.4 蒲公英多糖質(zhì)量濃度對清除O-2·的影響

見圖2。

圖2 蒲公英根多糖質(zhì)量濃度對O-2·清除率的影響

由圖2可知，在實驗所選取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蒲公英根多糖與Vc相比較對O-2·的清除率具有相同趨勢，都隨著濃度的增大而升高，且蒲公英根多糖的清除率與Vc的清除率十分接近，說明蒲公英根多糖對O-2·自由基的清除很強。

2.5 DPPH測定的色譜專屬性實驗

在1.7.1色譜條件下，DPPH自由基的出峰時間為9.87min，而多糖和溶劑等在此色譜條件下無色譜峰出現(xiàn)。見圖3。

圖3 色譜圖（A：DPPH溶液；B：蒲公英根多糖溶液；C：乙醇+蒸餾水溶液）

2.6 蒲公英多糖質(zhì)量濃度對清除DPPH·的影響

見圖4。

圖4 蒲公英根多糖質(zhì)量濃度對DPPH·清除率的影響

由圖可知，蒲公英根多糖對DPPH·具有很明顯的清除作用，清除效果隨著濃度的增加而增大，當濃度為3.0mg／m L時，蒲公英根多糖對DPPH·的清除率已高達95.4%基本與VC的清除率相同。

3 討論

本實驗在利用建立Fenton反應體系模型測定羥基自由基時，使用了兩種方法，一種為鄰二氮菲亞鐵為顯色劑的方法，一種為番紅花紅為顯色劑的方法，實驗的結(jié)果是測定多糖的抗羥基自由基不能使用鄰二氮菲亞鐵為顯色劑，因為在反應中會產(chǎn)生沉淀干擾吸光度的測定，即使采用離心除去沉淀的方法，但數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性仍然較差。而使用番紅花紅T為顯色劑時，則沒有沉淀產(chǎn)生，重現(xiàn)性較好，較為適合蒲公英根多糖的清除羥基自由基的測定。本實驗的研究表明，蒲公英根多糖對O2-·、·OH和DPPH·均具有明顯的清除作用，均隨著多糖液濃度的增加而增強，有著明顯的量效關(guān)系，在清除超氧陰離子自由基時發(fā)現(xiàn)它的清除能力與VC相當?？傊压⒏嗵菍?種自由基的清除能力由強到弱總體趨勢是：O2-·＞·OH＞DPPH·。蒲公英在東北蘊藏量很大，蒲公英根中總糖含量較高，超聲波協(xié)同酶法提取的多糖的提取率為15.83%，其含糖高達83.31%有很高的應用價值。因此，蒲公英根可以作為一種有效的自由基清除劑使用，有很好的開發(fā)和應用的前景，將來會成為我們理想的天然抗氧化劑首選之一。

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