鹿瓜多肽注射液對PMMA顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

陳 雷，李長德，于 洋，張志光

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)最普遍的并發(fā)癥就人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)，而人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)的直接原因就是關(guān)節(jié)假體周圍的骨溶解。大量實(shí)驗(yàn)表明，磨損微粒是引起骨溶解的主要原因［1］。主要磨損微粒有骨水泥顆粒(PMMA)聚乙烯顆粒(UHMPE)、鈦合金微粒等。這些磨損顆粒通過刺激假體周圍組織中的炎性細(xì)胞分泌大量的炎癥因子如TNF-α、IL-l、IL-6及PGE2等來進(jìn)一步刺激活化破骨細(xì)胞促進(jìn)骨吸收［2］。炎癥因子還可以減弱成骨細(xì)胞的活性，使膠原合成減少，降低成骨細(xì)胞的成骨能力；也可促使前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，從而使破骨細(xì)胞凋亡受到抑制，進(jìn)而破骨細(xì)胞的活性得到增強(qiáng)，所以關(guān)節(jié)假體周圍的骨溶解并不是人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)的唯一原因，而關(guān)節(jié)假體周圍的骨成骨能力下降，骨吸收能力升高等共同作用，破壞了骨生成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而引起假體周圍骨溶解，導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)假體的無菌性松動(dòng)［3］。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠體內(nèi)PMMA顆粒顱骨溶解模型，來研究鹿瓜多肽注射液在PMMA顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解及破骨細(xì)胞形成及功能中的作用，為臨床運(yùn)用鹿瓜多肽注射液預(yù)防和治療人工假體周圍骨溶解導(dǎo)致的人工關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用BALB/C7-9周齡的清潔級小鼠，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，鹿瓜多肽注射液(哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)有限公司)，PMMA顆粒(上海倍爾康生物醫(yī)學(xué)科技有限公司)，ELISA TNF-a 、IL-1、IL-6、PGE2 試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2 PMMA顆粒

實(shí)驗(yàn)用磨損顆粒采用PMMA顆粒(上海倍爾康生物醫(yī)學(xué)科技有限公司)，形態(tài)規(guī)則，平均直徑0.2～0.5μm。首先將PMMA顆粒溶于75%乙醇，室溫下震蕩洗浴4次，每次1小時(shí)，然后經(jīng)100%乙醇浸泡過夜后用PBS震蕩清洗4次，每次1小時(shí)，最后將處理好的PMMA顆粒重懸于α-MEM培養(yǎng)基中，配成濃度為30g/L的溶液，4℃保存?zhèn)溆?。?jīng)此處理后根據(jù)商業(yè)檢測試劑盒(廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)檢測，顆粒內(nèi)毒素小于0.25Eu/mL。

1.3 小鼠顱骨的骨吸收模型建立

每只小鼠采用3%的水合氯醛腹腔內(nèi)注射，待麻醉滿意后，備皮刀剔除小鼠頭頂部毛，碘伏術(shù)區(qū)消毒，在小鼠顱骨正中矢狀縫位置頭皮切開大小約0.5cm×0.5cm，暴露顱骨外骨膜，注意保護(hù)骨膜，顯現(xiàn)冠狀縫、矢狀縫及人字縫，取100μL不含PMMA顆粒的α-MEM及30g/L PMMA顆粒的α-MEM懸液置于切口處，1號線間斷縫合頭部皮膚，防止懸液漏出。術(shù)畢小鼠清醒后按照實(shí)驗(yàn)要求喂養(yǎng)及注射各種藥物。

1.4 ELISA 法檢測血清 TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2 水平

2周后小鼠麻醉后，取腹主動(dòng)脈血，靜置，3000r/min離心10min，取血清于EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｃ靠追謩e加入樣品、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品各100μL，37℃溫育30min后加入酶標(biāo)偶合液、底物、終止液50μL，于450nm波長讀取OD值。

1.5 小鼠顱骨組織切片制備及組織學(xué)分析

制備方法參考 Warashina等［4］實(shí)驗(yàn)步驟。具體如下：2周后所有小鼠脫頸處死，取顱骨蓋帽。固定，脫鈣、脫水、石蠟包埋，正中矢狀縫上切開顱骨為左右兩半，以切面向下包埋組織。石蠟切片4.5μm，在正中矢狀縫兩側(cè)各切兩張，分別行HE染色，TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色。TRAP染色方法詳見試劑盒使用說明書。

2 結(jié)果

空白組A組細(xì)胞液中的TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2含量最低，單純PMMA顆粒處理B組細(xì)胞液中的TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2含量最高。PMMA顆粒處理各組細(xì)胞液中的TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2含量均較空白對照A組明顯增加，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。經(jīng)過鹿瓜多肽注射液治療的 C、D、E 組細(xì)胞液中的 TNF- α、IL-1、IL-6、PGE2的含量較單純PMMA顆粒處理的B組細(xì)胞液中的TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2含量降低，差異有顯著性意義(P ＜0.05)。其中E組降低最為明顯，與C、D組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。5mL/kg鹿瓜多肽注射液C組與10mL/kg鹿瓜多肽注射液D組之間比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。20mL/kg鹿瓜多肽注射液E組與單純PMMA顆粒處理B組之間差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。見表1。

表1 各組血清TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2表達(dá)()

表1 各組血清TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2表達(dá)()

*陰性組與其他各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！镪栃越M與其他各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 TNF-α IL-1 IL-6 PGE2 A組 65.54±1.69★ 57.63±2.14★ 24.57±2.32★ 20.46±1.16★B組 155.79±2.36* 135.89±4.17* 80.51±3.62* 78.74±2.26*C 組 136.34±3.76＊★ 117.73±5.23＊★ 69.35±2.81＊★ 65.67±3.44＊★D 組 125.51±2.47＊★ 103.57±3.48＊★ 61.61±2.56＊★ 58.23±2.13＊★E 組 81.84±1.37＊★ 73.62±2.42＊★ 42.67±1.48＊★ 39.33±2.48＊★

HE染色提示在置入PMMA顆粒后，在顱頂骨的骨吸收明顯增加，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂及骨計(jì)算顱骨正矢狀線骨破壞溶解面積。PMMA顆粒處理各組顱骨正矢狀線骨破壞溶解面積均較空白對照A組明顯增加，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。經(jīng)過鹿瓜多肽注射液干預(yù)的各組骨破壞溶解面積較單純 PMMA顆粒處 B理組減少，差異有顯著性意義(P＜0.05)。而鹿瓜多肽注射液各組間比較可知20mL/kg鹿瓜多肽注射液E組的骨破壞溶解面積最少，與其他2組相比，差異有顯著性意義(P＜0.05)，5mL/kg鹿瓜多肽注射液C組與10mL/kg鹿瓜多肽注射液D組之間比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。20mL/kg鹿瓜多肽注射液E組與單純PMMA顆粒處理組之間差異有非常顯著性意義(P ＜0.01)。見表2。

表2 各組間骨破壞溶解面積差異比較()

表2 各組間骨破壞溶解面積差異比較()

*陰性組與其他各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！镪栃越M與其他各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)組 骨破壞溶解面積A組 0.068±0.014★B組 0.437±0.021*C 組 0.204±0.021＊★D 組 0.178±0.024＊★E組 0.107±0.052＊★

TRAP染色表明在置入PMMA顆粒后破骨細(xì)胞數(shù)目增加。PMMA處理各組中，破骨細(xì)胞數(shù)目均較空白對照A組明顯增加，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。經(jīng)過鹿瓜多肽注射液干預(yù)的各組中，破骨細(xì)胞數(shù)目較單PMMA處理B組減少，差異有顯著性意義(P＜0.05)。而鹿瓜多肽注射液干預(yù)的各組間比較可知20mL/kg直射用鹿瓜多肽E組的破骨細(xì)胞數(shù)目最少，與其他2組相比，差異有顯著性意義(P ＜0.05)，5mL/kg鹿瓜多肽注射液C組與10mL/kg鹿瓜多肽注射液D組之間比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。20mL/kg鹿瓜多肽注射液E組與單純PMMA處理B組之間比較，差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。見表3。

表3 各組間實(shí)驗(yàn)區(qū)域破骨細(xì)胞數(shù)差異比較()

表3 各組間實(shí)驗(yàn)區(qū)域破骨細(xì)胞數(shù)差異比較()

*陰性組與其他各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。★陽性組與其他各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)組 破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)A組 8.1±1.3★B組 30.4±3.6*C 組 21.7±2.4＊★D 組 19.5±1.7＊★E組 10.2±2.2＊★

3 討論

當(dāng)今全球每年有超過數(shù)百萬臺人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)，而人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)也就成為全球范圍內(nèi)最為普遍的人工關(guān)節(jié)置換術(shù)并發(fā)癥，大量實(shí)驗(yàn)表明，磨損微粒是引起骨溶解的主要原因［1］。主要磨損微粒有骨水泥顆粒(PMMA)聚乙烯顆粒(UHMPE)、鈦合金微粒等。這些磨損顆粒通過刺激假體周圍組織中的炎性細(xì)胞分泌大量的炎性因子如TNF-α、IL-l、IL-6及PGE2等來進(jìn)一步刺激活化破骨細(xì)胞促進(jìn)骨吸收［2］。

大量研究都集中在TNF-α介導(dǎo)炎性界膜的形成。這些細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)在磨損顆粒刺激下可以產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)和多種細(xì)胞因子，其中 TNF-α、IL-l、IL-6、PGE2、核因子B受體活化因子配體等在誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、破骨細(xì)胞形成及骨吸收等方面起著重要的作用［5］。破骨細(xì)胞是從單核-巨噬細(xì)胞系的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化來的多核細(xì)胞，是骨吸收中最重要的細(xì)胞。磨損顆粒促使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括磨損顆粒地直接作用和與巨噬細(xì)胞引起假體周圍細(xì)胞因子環(huán)境的變化有關(guān)。巨噬細(xì)胞在磨損顆粒不斷的刺激下，產(chǎn)生大量促炎性遞質(zhì)和蛋白水解酶類。尤其是 TNF- α、IL-l、IL-6、PGE2、巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化增值，最后導(dǎo)致骨溶解吸收［6，7］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的鹿瓜多肽注射液：為復(fù)方制劑，其組分為：鹿科動(dòng)物梅花鹿(Cervus Nippon Temmick)的骨骼和葫蘆科植物甜瓜(Cucumismelo L.)的干燥成熟種子，經(jīng)分別提取后制成的滅菌水溶液。鹿瓜多肽注射液中的骨誘導(dǎo)多肽類生物因子可有效促進(jìn)機(jī)體內(nèi)影響骨形成和吸收的骨源性生長因子的合成。包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)，β-轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等，從而具有多種生物活性，調(diào)節(jié)骨礦物質(zhì)代謝、抑制骨破壞、減少破骨作用、促進(jìn)骨代謝平衡而治療骨質(zhì)疏松的作用。其主要藥理作用有：促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，分化作用，趨化作用和溶骨活性，其中BMPs是一組酸性低分子量糖蛋白，作為一種高效骨誘導(dǎo)物質(zhì)，BMPs是間充質(zhì)細(xì)胞向骨系細(xì)胞分化的最初信號分子，能誘導(dǎo)血管周圍游動(dòng)的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不可逆性的骨系細(xì)胞，即軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，從而促進(jìn)新骨形成，增加骨鈣沉積；此外，BMPs還可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變。并通過與TGF-β和FGF相互之間的協(xié)調(diào)作用更好地誘導(dǎo)新骨形成，使骨組織更成熟。TGF-β則是一族具有多種功能的蛋白多肽，對成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞有促進(jìn)分化或降低分化的雙重調(diào)節(jié)作用，與多種因子如細(xì)胞外基質(zhì)和其他分化調(diào)節(jié)生長因子一起協(xié)同參與對細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)；TGF-β可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，可以直接刺激成纖維細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并對其新合成的基質(zhì)降解有顯著抑制作用；對于成骨細(xì)胞，TGF-β可促進(jìn)其合成Ⅰ型膠原，骨粘連素和骨橋蛋白；同時(shí)，TGF-β對淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用表明，它即能緩解炎性反應(yīng)的破壞性，又能協(xié)助巨噬細(xì)胞來源的某些細(xì)胞因子在組織修復(fù)中發(fā)揮作用。FGF是一組肝素黏合多肽，可刺激細(xì)胞的趨向移動(dòng)，增殖和分化，增加合成膠原細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)骨膠原蛋白及非膠原蛋白的合成，增加骨鈣素的合成。甜瓜籽提取物是從葫蘆科植物甜瓜(Cucumismelo L.)的成熟干燥的種子經(jīng)特殊工藝提取而成，能降低骨折局部毛細(xì)血管通透性，減少炎性滲出，促進(jìn)局部血運(yùn)障礙的恢復(fù)；同時(shí)還能降低全血粘度及紅細(xì)胞聚集程度，改善骨痂局部的血液循環(huán)，為骨細(xì)胞提供一個(gè)良好的供血環(huán)境，另外還能抑制前列腺素的釋放，降低PGE2含量，在促進(jìn)骨折早期愈合中，甜瓜籽提取物與補(bǔ)充的骨誘導(dǎo)多肽類生物因子具有協(xié)同作用，促進(jìn)骨源性生長因子的合成。鹿瓜多肽注射液富含的多種游離氨基酸，為骨細(xì)胞合成BMPs、TGF-β、FGF等骨源性生物因子提供原料，促進(jìn)骨源性生物因子的合成。有機(jī)鈣、磷離子可參與鈣磷代謝，維持骨容量。

綜上所述，鹿瓜多肽注射液理論上能夠調(diào)節(jié)骨礦物質(zhì)代謝、抑制骨破壞、減少破骨作用、促進(jìn)骨代謝平衡。能夠抑制磨損顆粒刺激產(chǎn)生的IL-1、IL-6、TNF-α及PGE2等炎性因子的作用，從而抑制破骨細(xì)胞引起的骨溶解導(dǎo)致的人工關(guān)節(jié)松動(dòng)。

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