微柱凝膠技術(shù)檢測血型不規(guī)則抗體的臨床應用

寧 芳 粟明麗 鄧梅英

桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院輸血科，廣西桂林 541001

不規(guī)則抗體是指不符合ABO血型系統(tǒng)Landstemer法則的血型抗體，即抗-A、抗-B和抗-AB以外的血型抗體，此抗體常因輸血或妊娠等免疫刺激產(chǎn)生，多為IgG抗體，是引起免疫性輸血反應、新生兒溶血病、血型鑒定困難及疑難配血（型）等的主要原因之一。因此，輸血前不規(guī)則抗體篩查和鑒定可減少因血型不合引起的輸血反應，確保安全用血。特別對于患有特殊病種如：腫瘤、肝病、新生兒以及有妊娠史、輸血史的患者更為重要。在交叉配血前進行抗體的篩查及抗體性質(zhì)的鑒定，可為臨床輸血安全，預防新生兒溶血病的發(fā)生提供有力的保障，降低輸血反應發(fā)生的風險?，F(xiàn)將桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）輸血科進行的不規(guī)則抗體篩查和鑒定情況報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

2010年1月～2013年12月我院各臨床科室輸血患者不規(guī)則抗體篩查共計29 208例，其中男11 932例（40.85%），女 17 276例（59.15%）；年齡 1 d～98歲，平均（42.5±2.3）歲。

1.2 主要試劑與儀器

微柱凝膠Coomns檢測卡、專用標本離心機和孵育器（西班牙Daina公司）；篩選細胞、譜細胞（上海血液生物）；KA-2200型血型血清學多用離心機（日本久保田）。篩選細胞包括以下紅細胞血型系統(tǒng)的常見抗原：Rh、MNSs、P、Lewis、Kell、Duffy、Kidd 等。 檢測試劑均在有效期內(nèi)并嚴格按照試劑及儀器說明書操作使用。

1.3 方法

1.3.1 標本要求及處理 輸血前采集患者靜脈血2 mL，用EDTA抗凝在室溫下以1900r/min離心10min，分離血漿。

1.3.2 微柱凝膠技術(shù) 分別向微柱孔內(nèi)加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號0.8%～1.0%的抗體篩查細胞各 50 μL，并向微柱孔內(nèi)加入25 μL血漿，將卡放入專用孵育器內(nèi)孵育15 min后，置專用離心機內(nèi)離心9 min。

1.3.3 結(jié)果判定 紅細胞與相應抗體發(fā)生凝集，不能通過凝膠的縫隙，被擋在微柱上端者，試驗結(jié)果為陽性；紅細胞未與相應的抗體發(fā)生凝集，紅細胞通過凝膠的縫隙到達微柱底部，試驗結(jié)果為陰性。

1.3.4 抗體鑒定 用1～10號譜細胞對陽性結(jié)果進行抗體特異性鑒定。

2 結(jié)果

2.1 待測樣本不規(guī)則抗體陽性檢出率

在29 208例輸血患者的不規(guī)則抗體篩查中，共檢出不規(guī)則抗體90例，陽性率為0.31%。

2.2 不規(guī)則抗體特異性鑒定結(jié)果

90例不規(guī)則抗體陽性標本中，檢出同種抗體71例，其中抗-D 2例（2.22%），抗-E 19例（21.11%），抗-Ec 10 例（11.11%），抗-c 3 例（3.33%），抗-Mur 11 例（12.22%），抗-M 7 例（7.78%），抗-N 2 例（2.22%），抗-s 1例（1.11%），抗-Lea 8例（8.89%），抗-Leb 2例（2.22%），抗-JKa 1 例（1.11%），抗-JKb 2 例（2.22%），抗-P1 2例（2.22%），抗-Dia 1例（1.11%）；冷抗體 7例（7.78%）；自身抗體 12例（13.33%）。

2.3 各紅細胞血型系統(tǒng)中不規(guī)則抗體分布情況

各紅細胞血型系統(tǒng)中不規(guī)則抗體的發(fā)生分別為Rh系統(tǒng) 34例（47.89%）、MNSs系統(tǒng) 21例（29.58%）、Lewis系統(tǒng) 10例（14.08%）、Kidd系統(tǒng) 3例（4.23%）、P系統(tǒng) 2例（2.82%），Diego系統(tǒng) 1例（1.41%）。 其中，以Rh系統(tǒng)所占比例最高（47.89%）。

2.4 Rh血型系統(tǒng)中不規(guī)則抗體的分布情況

Rh血型系統(tǒng)中檢出的不規(guī)則抗體按照所占比例從高到低排列依次為：抗-E 19例（55.89%）＞抗-Ec 10例（29.41%）＞抗-c 3例（8.83%）＞抗-D 2例（5.88%）。

2.5 不規(guī)則抗體在不同性別所占比例和發(fā)生頻率

90例不規(guī)則抗體陽性標本中，女56例（62.22%），發(fā)生頻率為0.32%；男34例（37.78%），發(fā)生頻率為0.28%。

3 討論

隨著輸血檢測技術(shù)的發(fā)展，因為血型不合而引起的溶血反應比較少見，而血型不規(guī)則抗體引起溶血性輸血反應成為主要原因。近年來，血型不規(guī)則抗體的篩查越來越多地應用于臨床輸血，尤其是孕婦、多次輸血患者、自身免疫性疾病患者、腫瘤患者、嚴重消耗性疾病患者等均為血型不規(guī)則抗體的高危攜帶者，應作為重點篩查對象，保障輸血的安全性和有效性。不規(guī)則抗體產(chǎn)生的數(shù)量和質(zhì)量變化與抗原、B細胞、T細胞及附屬細胞等多種因素密切相關(guān)。當機體受到抗原刺激后（大部分是在T細胞的輔助作用下），B細胞增殖并分化成熟為記憶細胞或漿細胞。記憶細胞只在其細胞膜上表達抗體，當再次受到同一抗原刺激后，則可快速引發(fā)免疫反應。例如在輸血免疫時，尤其是多次輸血，紅細胞血型系統(tǒng)的抗原（多是少見抗原）可刺激機體產(chǎn)生相應抗體，當再次輸血時，由于組織相容性復合體MHCⅠ和MHCⅡ分子通過調(diào)節(jié)T細胞的反應，調(diào)控機體抗體反應，同時還在神經(jīng)內(nèi)分泌作用、B細胞免疫耐受、細胞因子等綜合因素的作用下，在諸如多發(fā)性骨髓瘤、腫瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肺結(jié)核、肝硬化、自身免疫性疾病、嚴重消耗性疾病等疾患中，血清中的IgM和IgG類抗體會增高。在進行臨床輸血治療時應進行血型不規(guī)則抗體篩查，對于篩查陽性者應并進一步明確不規(guī)則抗體的性質(zhì)，以最大程度減少輸血并發(fā)癥的發(fā)生[1]。

不規(guī)則抗體篩查其目的是確保輸血的安全。選用靈敏度高、特異性好、結(jié)果準確的方法進行輸血前常規(guī)的抗體檢測，可發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的不規(guī)則抗體，對保證臨床輸血安全有著極為重要的意義。檢測紅細胞血型不規(guī)則抗體的方法很多，以往通常使用間接抗人球蛋白實驗篩查抗體，是為了解決部分抗體的劑量效應[2]而采用的，此實驗耗時耗人工不利于常規(guī)檢測，近年來開展的微柱凝膠技術(shù)解決了上述問題，微柱凝膠技術(shù)是在傳統(tǒng)的抗人球蛋白試驗反復基礎上發(fā)展起來的，克服了傳統(tǒng)試管液體介質(zhì)Coombs試驗需多次洗滌等繁瑣、費時的缺點，其基本原理是利用微柱凝膠的微孔過濾作用及免疫化學抗原抗體特異性反應，紅細胞若沒有被致敏或沒有遇到相應的紅細胞抗體，則在離心過程中會直接離心到凝膠底層，表示不存在致敏紅細胞和相應抗體；若有特異性的抗體與紅細胞結(jié)合，對于IgM類抗體，則直接形成可見的復合物，對于IgG類抗體則此復合物再與多特異的抗球蛋白結(jié)合形成可見的復合物，并被阻隔在凝膠層頂部，即表示存在致敏紅細胞和相應抗體[3]，具有標準化程度高、重復性強、試驗結(jié)果明確可靠、標本用量少、保存時間長等優(yōu)點[4]，不失為輸血前血型不規(guī)則抗體篩查的較好方法，本研究采用這一方法對29 208例輸血患者進行不規(guī)則抗體檢測，檢出陽性抗體90例，不規(guī)則抗體陽性檢出率為0.31%，與相關(guān)文獻報道相符[5]。當不規(guī)則抗體篩查陽性時，必須進一步做抗體鑒定，確定其特異性后，選擇輸注無相應抗原的紅細胞，才能確?；颊叩妮斞踩?/p>

實驗結(jié)果顯示，檢測出的不規(guī)則抗體大多數(shù)屬于Rh血型系統(tǒng)，占陽性抗體的 37.77%（34/90），臨床輸血中Rh血型系統(tǒng)的意義僅次于ABO血型系統(tǒng)。雖然Rh血型系統(tǒng)5種抗原的免疫性強弱依次為 D＞E＞C＞c＞e[6]，但本次實驗檢出抗-D抗體比例不高，陽性者僅2例，而抗-E抗體陽性為 19例，其陽性比例遠高于抗-D抗體，有文獻報道臨床輸血產(chǎn)生抗-E抗體的概率要比抗-D高2.5倍[7]，本實驗也呈現(xiàn)與此相符的結(jié)果，考慮其原因可能：目前各家醫(yī)院對輸血患者都開展了 Rh（D）抗原的檢測，對 Rh（D）陰性患者進行了同型輸血，故臨床上產(chǎn)生抗-D抗體的概率及檢出率均降低，而Rh（E）抗原尚未列入常規(guī)檢查中，E抗原陰性患者的輸血則為隨機性，并未進行配合性輸血，致使Rh（E）陰性患者通過輸血接受E抗原刺激后產(chǎn)生抗-E抗體的概率增多，臨床上檢出率也就相應的增高，基于這一因素我國人群中Rh（E）抗原陰性頻率高于Rh（D）抗原，而E抗原是Rh血型系統(tǒng)中除D抗原之外最強的抗原之一，輸血患者中的Rh（E）抗原陰性的存在，將可能成為引起輸血不良反應的一個隱患[8]。臨床上凡是以IgG性質(zhì)出現(xiàn)的不規(guī)則抗體，理論上都可以引起新生兒溶血病，對有輸血史和妊娠史的孕婦尤為重要，若檢出不規(guī)則抗體，應及時作相應的預防和治療，可避免新生兒溶血病和輸血不良反應的發(fā)生。此次實驗也鑒定出MNSs血型系統(tǒng)不規(guī)則抗體21例，Lewis系統(tǒng)不規(guī)則抗體10例，分別占抗體陽性的29.58%（21/90）和 14.08%（10/90），據(jù)文獻資料提示 MNSs系統(tǒng)的復雜性僅次于Rh系統(tǒng)[9]，抗M及抗N抗體多數(shù)以IgM形式存在，其反應溫度為4～22℃，因而對于輸血而言，只有在37℃或抗球蛋白試驗陽性時，該抗體才具臨床意義[10]，除了抗M及抗N抗體外，抗Mur抗體也可引起交叉配血困難和溶血性輸血反應發(fā)生[11]。篩查中檢出Lewis系統(tǒng)為抗-Lea抗體8例，抗-Leb 2例。Lewis血型抗體以IgM類為主，在37℃抗球蛋白介質(zhì)中有反應，可以結(jié)合補體導致體內(nèi)溶血的發(fā)生，此抗體的檢出具有臨床意義。由于Lewis血型系統(tǒng)的抗體的效價及親和力較低，在日常工作中容易漏檢[12]，當檢測結(jié)果出現(xiàn)弱陽性或可疑情況時，應高度注意是否有此類抗體的存在，最好重復試驗或改用抗球蛋白試驗等其他方法進一步證實，以免漏檢。

本次抗體篩查檢出非特異性自身抗體陽性12例，占陽性抗體的13.33%，此類情況以自身免疫性疾病患者、惡性血液病和惡性腫瘤患者居多，其次為感染性疾病患者。自身抗體陽性多見于自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜等疾病，大部分為溫抗體，在本實驗中常出現(xiàn)多凝集現(xiàn)象，造成交叉配血困難。當患者存在較強的溫自身抗體時，需鑒別是否同時存在同種抗體，在37℃體內(nèi)由于自身抗體的作用，使自身紅細胞上的所有抗原位點都可封閉而掩蓋同種抗體，有可能引發(fā)嚴重的溶血性輸血反應發(fā)生[13]。此時應建議臨床醫(yī)師盡量不采用輸血治療，先疾病治療，待患者抗體效價降低或消失后再輸血。

此次研究發(fā)現(xiàn)，90例抗體陽性患者中，男性患者34例，女性患者 56例，男性陽性檢出率 0.28%（34/11 932），女性陽性檢出率 0.32%（56/17 276），與文獻報道相近[14]，提示女性產(chǎn)生不規(guī)則抗體的概率高于男性。這可能與女性在妊娠或流產(chǎn)等生理或非生理的因素影響下，機體受到免疫刺激有關(guān)，且同時存在著輸血和妊娠雙重免疫機會，所以女性的不規(guī)則抗體檢出率高于男性患者[15]。

從29 208例次輸血患者中篩查出的90例抗體陽性患者，均采用Diagnostic Coomns檢測卡進行抗體鑒定和交叉配血，輸血時選擇了各自對應抗原陰性的血液制品給予輸注，患者在輸血過程中和輸血后均未發(fā)生不良反應，達到了安全輸血的療效。

綜上所述，在輸血前對輸血患者進行不規(guī)則抗體篩查，可及時發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)存在具有臨床意義的不規(guī)則抗體，特別對女性患者尤為重要。抗體篩查對保證輸血安全，避免輸血反應的發(fā)生起著非常重要的作用。

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