腺病毒過表達(dá)TXNIP對INS-1胰島細(xì)胞損傷和凋亡的影響

劉曉波 楊嘯 姚艷玲 張倩 焦向英

基礎(chǔ)研究

腺病毒過表達(dá)TXNIP對INS-1胰島細(xì)胞損傷和凋亡的影響

劉曉波 楊嘯 姚艷玲 張倩 焦向英

目的 觀察TXNIP過表達(dá)是否可以引起正常培養(yǎng)條件下的胰島細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡，分析TXNIP引起細(xì)胞損傷和凋亡的下游途徑，以進(jìn)一步明確TXNIP在糖尿病中引起各器官細(xì)胞損傷的機(jī)制。方法 將使用正常糖脂濃度培養(yǎng)的胰島細(xì)胞分為4組：正常培養(yǎng)組、Ad-eGFP空病毒組、Ad-TXNIP過表達(dá)組和Ad-TXNIPC247S點突變過表達(dá)組。結(jié)果 與Ad-eGFP空病毒組相比，兩個過表達(dá)組的TXNIP mRNA水平、TXNIP蛋白水平均顯著升高，表明病毒轉(zhuǎn)染成功，TXNIP成功過表達(dá)。與空病毒組相比，Ad-TXNIP過表達(dá)組TXNIP與Trx的結(jié)合量升高（1.67±0.08比1.06±0.05，P＜0.05），而 Trx活性顯著降低（0.42±0.11比1.13±0.14，P＜0.01）；LDH 活性［（498.8±55.62）U/L 比（266.2±36.49）U/L，P＜0.01］、caspase-3 活性［（3.799±0.330）nmol·h-1·mg-1pro 比（0.979±0.100）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.01］及 p38 激酶活性（2.45±0.22 比 1.10±0.08，P＜0.01）均顯著增高。與Ad-TXNIP過表達(dá)組相比，C247S點突變的TXNIP過表達(dá)組TXNIP與Trx的結(jié)合量減少，Trx活性明顯升高，LDH 活性［（421.6±41.31）U/L 比（498.8±55.62）U/L，P＜0.05］和 caspase-3活性［（3.377±0.290）nmol·h-1·mg-1pro 比（3.799±0.330）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.01］較低，p38 激酶活性（0.80±0.07比2.45±0.22，P＞0.05）明顯降低。結(jié)論 單純過表達(dá)TXNIP可以引起正常糖脂濃度培養(yǎng)條件下的胰島細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡。TXNIP介導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡的機(jī)制一方面與其抑制Trx活性、增加自由基損傷、增加ASK1-p38激酶依賴的凋亡途徑有關(guān)，同時也有不依賴結(jié)合抑制Trx的途徑存在。TXNIP的表達(dá)上調(diào)是糖尿病引起胰島細(xì)胞損傷和凋亡的重要原因。

硫氧還蛋白； 硫氧還蛋白相互作用蛋白； 胰島細(xì)胞； 凋亡； 突變

近年來，全球糖尿病的發(fā)病率迅速升高，已成為威脅人類健康的重要疾病[1]。而我國又是全世界糖尿病患者最多的國家[2]。近年來有研究表明，在糖尿病患者和糖尿病動物的血清和組織中，硫氧還蛋白相互作用蛋白（Trx interacting protein，TXNIP）的表達(dá)顯著增高，是最突出的變化之一。TXNIP是目前已知的唯一一種內(nèi)源性硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）的結(jié)合抑制蛋白[3]，它可通過其第247位的半胱氨酸與還原型的Trx之Cys32或Cys35結(jié)合[4]，從而削弱其抗自由基和抗凋亡作用，引起細(xì)胞損傷和凋亡。

本實驗室前期觀察到使用RNA干擾抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞TXNIP表達(dá)上調(diào)后，細(xì)胞Trx活性顯著提高，高糖高脂引起的心肌細(xì)胞凋亡顯著減輕[5]。而在正常培養(yǎng)的H9C2轉(zhuǎn)染過表達(dá)TXNIP的腺病毒，可使正常糖脂濃度培養(yǎng)條件下心肌細(xì)胞Trx活性顯著降低，凋亡顯著加重[6]。提示糖尿病可通過上調(diào)TXNIP表達(dá)，進(jìn)而抑制Trx的活性，增加自由基損傷和激活p38激酶，引起心肌細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡。但作為一種ɑ-阻抑蛋白，TXNIP本身是否還可通過非Trx依賴的途徑引起細(xì)胞凋亡和損傷，目前尚不清楚。因此，本課題使用247位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，喪失與Trx結(jié)合能力的突變TXNIP過表達(dá)病毒，與非突變過表達(dá)病毒比較，轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞，以分析TXNIP對胰島細(xì)胞的損傷作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要儀器和試劑 SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺（蘇州安泰空氣凈化有限公司），Heracell 150i CO2培養(yǎng)箱（美國THERMO ELECTRON公司），IX51倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），Mx3005P Real-Time PCR儀（美國STRATAGENE公司），S/N E10023酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），BIO-RAD電泳儀和半干轉(zhuǎn)?。绹鳥IO-RAD公司），JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所），Kodak Image Station 400（美國 Kodak公司）。

INS-1胰島細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）均購于Hyclone公司（美國），0.25%含EDTA胰酶購于Gibco公司（美國）。Ad-TXNIP-eGFP腺病毒、Ad-TXNIPc247s-eGFP點突變腺病毒和Ad-eGFP對照腺病毒與賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司合作構(gòu)建獲得，病毒滴度為1×1010pfu/ml。免疫共沉淀試劑盒購于Thermo公司（美國），乳酸脫氫酶測定試劑盒購于南京建成生物集團(tuán)有限公司，p38激酶活性測定試劑盒和TXNIP一抗均為Cell Signaling公司（美國），Trx一抗購于 Millipore公司（美國），caspase-3活性試劑盒購自美國BIOMOL公司，RNA提取液（RNAiso Plus）購于上海生物工程有限公司。

1.1.2 INS-1胰島細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%FBS、抗生素（50 U/ml青霉素+50 U/ml鏈霉素）的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞待長到80%滿時進(jìn)行傳代和轉(zhuǎn)染處理。傳代時先用PBS沖洗2次，吸干PBS，加入400 μl 0.25%含EDTA胰酶室溫下消化1 min，鏡下觀察大部分（80%～90%）細(xì)胞變圓，吸出胰酶，及時加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打，傳至2瓶，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染方法：前一天將細(xì)胞按1×106種于六孔板。第2天先吸出培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次并吸干。按感染復(fù)數(shù)（MOI）=100，每孔 1 ml病毒稀釋液（10 μl病毒混入990 μl不含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基混勻液）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4 h后補(bǔ)含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后換液，24、48和72 h時分別觀察轉(zhuǎn)染效率，于轉(zhuǎn)染效率最高時收集上清和細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2 分組及方法

1.2.1 分組 將用正常糖脂濃度培養(yǎng)的INS-1胰島細(xì)胞分為4組，即正常培養(yǎng)組、正常+Ad-eGFP空病毒組、正常+Ad-TXNIP-eGFP過表達(dá)組、正常+Ad-TXNIPC247S-eGFP點突變過表達(dá)組，均于轉(zhuǎn)然后72 h收集培養(yǎng)基和細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.2.2 方法

1.2.2.1 熒光顯微鏡下觀察并計算轉(zhuǎn)染效率 利用熒光倒置顯微鏡拍攝同一個視野下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計算同一個視野下帶綠色熒光蛋白細(xì)胞占整個視野下所有細(xì)胞的百分比即為轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2.2 Real-time PCR方法測定培養(yǎng)的INS-1胰島細(xì)胞TXNIP的mRNA表達(dá) INS-1細(xì)胞RNA提取使用RNAiso Plus，cDNA合成使用PrimeScriptTM RTreagent Kit。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃、15 min；85℃、5 s；4℃保存。Real-time PCR檢測儀器為Mx3005P realtime PCR儀。反應(yīng)條件：Segment 1為95℃、30 s，1個循環(huán)；Segment 2為95℃、5 s，60℃、20 s，40個循環(huán)；Segment 3為 95 ℃、1 min，55 ℃、30 s，95℃、30 s，1個循環(huán)。結(jié)果判定采用相對定量結(jié)果計算（2－ΔΔCt法）。所使用的相關(guān)基因引物序列 如 下 ：GAPDH 上 游 引 物 ：5′-2ATGGTGAAGGTCGGTGTG2-3′，GAPDH 下 游 引 物 ：5′-2AACTTGCCGTGGGTAGAG2-3′。TXNIP 上游引物：5′-GGCAATCAGTAGGCAAGTCTCCA-3′，TXNIP 下游引物：5′-TTCCGACATTCACCCAGCAA-3′。結(jié)果表示以正常對照組的平均值作為100%，計算其余各組與之相比的相對值。

1.2.2.3 Western blot方法測定培養(yǎng)72 h后INS-1胰島細(xì)胞Trx1、TXNIP的蛋白表達(dá) 將轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞從孵箱里取出，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，每皿內(nèi)加入裂解液50 μl，吸入1.5 ml EP管內(nèi)，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞，并以10 000 rpm、4℃離心10 min，取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取等量蛋白（50 μg）進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分離（BIO-RAD）。設(shè)置參數(shù)：80 V，預(yù)電泳20 min；進(jìn)入分離膠后，120 V，電泳90～110 min。轉(zhuǎn)膜參數(shù)為：15 V，20 min。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（BIORAD）上，膜置于5%BSA封閉液中2 h。一抗孵育：用 TBST 稀釋一抗（Trx：1∶2500；TXNIP：1∶1250；βactin：1∶1000），將封閉好的膜置于其中，4 ℃輕搖過夜，次日室溫TBST輕搖洗膜4次，每次5 min。加入到相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（均為1∶2000稀釋）于室溫下孵育1.5 h。同樣方法洗膜20 min。加入DAB顯色液，室溫下孵育3 min，用Kodak成像掃描儀掃描拍攝蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參照，實驗在相同的條件下至少重復(fù)6次。結(jié)果表示以正常對照組的平均值作為100%，計算其余各組蛋白表達(dá)量與之相比的相對值。

【凈點頭介】是呀，這樣人該殺的，小弟回去，即著人訪拿。【向末介】老妹丈就此同行罷。【末】請舅翁先行一步，小弟隨后就來?！靖眱粝騼艚椤啃〉芘c令妹丈不啻同胞。

1.2.2.4 Trx與TXNIP結(jié)合檢測 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次、吸干，加入預(yù)冷的Lysis/Wash Buffer，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5 ml EP管中，4℃搖晃15 min，再4℃ 14 000 rpm離心15 min，取上清液，加入80 μlControl Agarose Resin 和100 μl Coupling Buffer，4 ℃搖晃30～60 min，然后4℃ 14 000 rpm離心10 min，去除Control A－garose Resin，取上清液，用BCA法做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度。每個反應(yīng)體系柱里加入10 μl 1 μg/μl Trx 抗體，10 μl 20×Coupling Buffer，180 μl三蒸水，3 μl Sodium Cyanoborohydride Solution，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜，每個柱子中加200 μl Quenching Buffer和 3 μl Sodium Cyanoborohydride Solution孵育15 min后再用Coupling Buffer洗2遍珠子并離心去上清，每個柱子加入500 μg/200 μl樣本，4℃緩慢搖動混合物過夜。加50 μl Elution Buffer游離抗原、抗體，收集上清液，電泳前加入Lane Marker Sample Buffer煮5 min變性，放置室溫靜止15 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。之后步驟參照1.2.2.3中TXNIP的蛋白表達(dá)量的檢測。結(jié)果表示以正常對照組的平均值作為100%，計算其余各組蛋白表達(dá)量與之相比的相對值。

1.2.2.5 INS-1胰島細(xì)胞硫氧還蛋白（Trx）活性的測定 用胰島素還原法檢測INS-1細(xì)胞Trx活性，即將胰島細(xì)胞裂解液（以Cell signaling公司的cell lysis buffer常規(guī)提取細(xì)胞蛋白，并測定蛋白濃度）與胰島素、TR和NADPH孵育。酶標(biāo)儀檢測412 nm處的OD值，計算出Trx的活性。結(jié)果表示以正常對照組的平均值作為100%，計算其余各組蛋白表達(dá)量與之相比的相對值。

1.2.2.6 培養(yǎng)基乳酸脫氫酶（LDH）活性測定 LDH廣泛存在于人體各組織中，細(xì)胞損傷后，細(xì)胞內(nèi)的LDH漏出到細(xì)胞外，因此可以通過測定培養(yǎng)基上清中LDH的活性反映胰島細(xì)胞損傷的程度。本實驗使用南京建成生物工程研究所乳酸脫氫酶測定試劑盒進(jìn)行測定。LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2’4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，在440 nm處有最大吸收峰，通過吸光度值可得出酶活力。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清0.5 ml，按乳酸脫氫酶測定試劑盒說明書操作并計算乳酸脫氫酶活性。

1.2.2.7 Caspase3活性測定 Caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡的最終共有途徑，可以反映凋亡發(fā)生的程度。取96孔酶標(biāo)板，設(shè)立樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，向每個樣品孔中分別加入2×反應(yīng)緩沖液50 μl，樣品裂解液 30 μl，蒸餾水 10 μl，底物（Ac-DEVD-AFC）工作液10 μl，振蕩混勻；向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度AFC標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μl，在酶標(biāo)儀中37℃避光孵育1.5 h，于激發(fā)光Ex 400 nm、發(fā)射光Em 508 nm下每隔15 min連續(xù)檢測其熒光密度值。以不同濃度AFC標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。各樣品caspase-3活性結(jié)果以每毫克蛋白單位時間分解底物Ac-DEVD-AFC而生成AFC的速度表示。計算公式：［AFC（1.5 h）－AFC（0 h）］/蛋白濃度/1.5 h（單位：nmol·h-1·mg-1protein）。

1.2.2.8 p38激酶活性測定 操作步驟嚴(yán)格按照cell signaling的 P38 MAP Kinase Assay Kit說明書進(jìn)行。在待測蛋白樣品中加入phosphor-38 MAPK抗體（每 200 μl細(xì)胞裂解物加 20 μl抗體），4 ℃輕搖過夜，14 000 g，30 s，4 ℃離心，棄上清，用 1×細(xì)胞裂解液和1×Kinase buffer各洗2次，用含ATP 200 mM 和 ATF 1 μl的 1×Kinase buffer 50 μl重懸沉淀，30℃ 孵育30 min，3×SDS樣品緩沖液終止反應(yīng)，煮樣，95 ℃～100 ℃，2～5 min，用 Western immunoblot的方法檢測ATF的表達(dá)量，用AlphaView Version 3.4.0.0圖像分析軟件進(jìn)行條帶分析。結(jié)果表示以正常對照組的平均值作為100%，計算其余各組與之相比的相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果以±s表示，組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率 鏡下觀察轉(zhuǎn)染成功，24 h、48 h、72 h 轉(zhuǎn)染效率分別 為 （9.97±2.15）%、（67.45±3.37）%、（89.96±4.32）%，其中轉(zhuǎn)染72 h的轉(zhuǎn)染效率顯著高于轉(zhuǎn)染24 h和轉(zhuǎn)染48 h（P均＜0.01）。因此該實驗我們選擇轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞做后續(xù)實驗分析。見圖1。

2.2 Real-time PCR方法測定轉(zhuǎn)染INS-1胰島細(xì)胞TXNIP的mRNA表達(dá) 與正常培養(yǎng)組相比，AdeGFP組細(xì)胞TXNIP的mRNA水平無顯著變化（1.07±0.17 比 1.00±0.22，P＞0.05）；過表達(dá)組與 AdeGFP組相比，TXNIP的 mRNA表達(dá)顯著升高（1.89±0.26 比 1.07±0.22，P＜0.05），點突變過表達(dá)組與Ad-eGFP相比，TXNIP的mRNA表達(dá)顯著升高（1.89±0.32 比 1.07±0.22，P＜0.05）。說明構(gòu)建載體、病毒包裝、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、過表達(dá)目的基因成功，且兩個過表達(dá)組TXNIP的mRNA水平無明顯差別。見圖2。

2.3 Western Blot方法測定TXNIP和Trx蛋白表達(dá) 與正常對照組相比較，Ad-eGFP組的TXNIP蛋白表達(dá)無顯著變化（1.04±0.05 比 1.00±0.04，P＞0.05）；而與Ad-eGFP組相比，過表達(dá)組和點突變過表達(dá)組的TXNIP蛋白水平均顯著升高（1.92±0.07比 1.04±0.05，P＜0.01；1.69±0.17 比 1.04±0.05，P＜0.01），進(jìn)一步說明病毒轉(zhuǎn)染及蛋白過表達(dá)成功。與Ad-eGFP組相比較，過表達(dá)組和點突變過表達(dá)組的Trx蛋白表達(dá)均無明顯變化（1.07±0.08比1.03±0.05，P＞0.05；1.09±0.07 比 1.03±0.05，P＞0.05），說明TXNIP表達(dá)增高并未抑制Trx蛋白表達(dá)。見圖3。

2.4 免疫共沉淀檢測TXNIP與Trx結(jié)合程度 與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組Trx與TXNIP的結(jié)合量無明顯變化（1.06±0.05 比 1.00±0.04，P＞0.05）；而與Ad-eGFP組相比、過表達(dá)組Trx與TXNIP的結(jié)合量顯著升高 （1.67±0.08 比 1.06±0.05，P＜0.05）；點突變過表達(dá)組與Ad-eGFP組相比無明顯變化（0.87±0.04 比 1.06±0.05，P＞0.05），提示點突變的過表達(dá)組的TXNIP不能與Trx相結(jié)合。見圖4。

2.5 Trx活性測定 與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組Trx活性無明顯變化（1.13±0.14比1.00±0.12，P＞0.05）；與 Ad-eGFP組相比，過表達(dá)組 Trx活性顯著降低（0.42±0.11 比 1.13±0.14，P＜0.01），提示TXNIP的過表達(dá)雖不會引起Trx蛋白表達(dá)量的改變，但是會明顯抑制Trx的活性。點突變過表達(dá)組與Ad-eGFP組相比，Trx活性無明顯變化（0.84±0.09 比 1.13±0.14，P＞0.05）；而與野生型過表達(dá)組相比，點突變過表達(dá)組細(xì)胞Trx活性明顯升高（0.84±0.09比 0.42±0.11，P＜0.01），提示 TXNIP 主要通過其247位的半胱氨酸與還原型的Trx結(jié)合抑制其活性。見圖5。

2.6 LDH活性的變化 與正常培養(yǎng)組相比，AdeGFP組LDH活性未見統(tǒng)計學(xué)差異［（295.6±37.22）U/L 比（266.2±36.49）U/L，P＞0.05］；過表達(dá)組與Ad-eGFP 組相比顯著升高［（498.8±55.62）U/L 比（266.2±36.49）U/L，P＜0.01］，提示 TXNIP 表達(dá)增高可引起胰島細(xì)胞損傷。點突變過表達(dá)組與Ad-eGFP組相比，LDH活性也明顯升高［（421.6±41.31）U/L比（266.2±36.49）U/L，P＜0.05］；但與野生型過表達(dá)組相比，LDH 活性較低 ［（421.6±41.31）U/L 比（498.8±55.62）U/L，P＜0.05］，提示 TXNIP 可以通過Trx依賴和非Trx依賴兩條途徑引起胰島細(xì)胞損傷。見圖6。

2.7 Caspase-3活性測定 與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組caspase-3活性未見統(tǒng)計學(xué)差異［（0.873±0.110）nmol·h-1·mg-1pro 比（0.979±0.100）nmol·h-1·mg-1pro，P＞0.05］；而過表達(dá)組與 AdeGFP組相比，caspase-3活性明顯增高［（3.799±0.330）nmol·h-1·mg-1pro 比（0.979±0.100）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.01］，提示TXNIP過表達(dá)引起胰島細(xì)胞顯著凋亡。點突變過表達(dá)組與Ad-eGFP組相比，caspase-3活性明顯升高［（3.377±0.290）U/L 比（0.979±0.100）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.01］；但與野生型過表達(dá)組相比，caspase-3活性較低［（3.377±0.290）U/L 比 （3.799±0.330）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.05］，提示TXNIP可以通過Trx依賴和非Trx依賴兩條途徑引起胰島細(xì)胞凋亡。見圖7。

2.8 p38激酶活性 與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組p38激酶活性無明顯改變（1.10±0.15比1.00±0.08，P＞0.05）；而過表達(dá)組與 Ad-eGFP 組相比 p38激酶活性顯著升高（2.45±0.22 比 1.10±0.08，P＜0.01）。點突變過表達(dá)組與Ad-eGFP組相比，p38激酶活性無明顯改變（0.80±0.07 比 1.10±0.08，P＞0.05），且明顯低于野生型過表達(dá)組（0.80±0.07比2.45±0.22，P＜0.01）。提示 TXNIP 過表達(dá)引起的 p38激酶活化主要是通過結(jié)合和抑制Trx活性，增加自由基的生成和堆積所介導(dǎo)的。見圖8。

3 討論

本實驗室近年對硫氧還蛋白系統(tǒng)變化與糖尿病心肌損傷的關(guān)系進(jìn)行了大量研究。在前期使用糖尿病動物模型和模擬高糖、高脂刺激的培養(yǎng)細(xì)胞上，均發(fā)現(xiàn)TXNIP表達(dá)明顯上調(diào)[7,8]，提示其與糖尿病及糖尿病引起的細(xì)胞損傷可能有著十分密切的關(guān)系。薛曉維等[5]在高糖、高脂培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞上，使用RNA干擾技術(shù)降低TXNIP的表達(dá)，我們觀察到Trx的表達(dá)雖無顯著的變化，但其活性明顯增高，同時心肌細(xì)胞p38激酶的活性和凋亡也明顯降低。在給予了外源性的Trx處理高糖、高脂刺激的培養(yǎng)細(xì)胞上，本實驗室也觀察到了類似的變化。但是并不清楚通過RNA干擾是阻斷了高糖、高脂所引起的TXNIP的高表達(dá)，還是抑制了細(xì)胞內(nèi)固有的TXNIP的表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生保護(hù)作用。因此，姚艷玲等[6]又在正常糖脂濃度培養(yǎng)條件下對H9C2使用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使TXNIP基因過表達(dá)，觀察到Trx的活性明顯降低，同時心肌細(xì)胞的凋亡也明顯升高，表明單純TXNIP的表達(dá)增加即可造成細(xì)胞的損傷和凋亡?；谥把芯空邔τ赥XNIP主要功能的認(rèn)識，這兩項研究均圍繞TXNIP結(jié)合抑制Trx抗凋亡的作用進(jìn)行研究，至于TXNIP是否可通過非Trx依賴的途徑引起細(xì)胞凋亡，我們并不清楚。

因此，本實驗中我們采用腺病毒使胰島細(xì)胞分別過表達(dá)野生型TXNIP蛋白和C247S點突變的TXNIP蛋白，觀察單純野生型TXNIP蛋白增多，或者因C247S點突變而喪失與Trx結(jié)合能力的TXNIP蛋白增多時對正常糖脂濃度培養(yǎng)條件下的胰島細(xì)胞損傷和凋亡的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，病毒轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染72 h后轉(zhuǎn)染效率達(dá)到高峰，野生型組與點突變組的TXNIP表達(dá)量較空病毒對照組mRNA水平和蛋白水平均顯著升高，表明病毒轉(zhuǎn)染是成功的。但點突變組與野生型組相比，TXNIP在mRNA水平未見明顯差異，但在蛋白水平則相對較低，重復(fù)實驗仍表現(xiàn)同樣結(jié)果。參考Chutkow等[9]的研究報道，這可能是由于Trx與TXNIP的結(jié)合可以提高TXNIP的穩(wěn)定性減少其降解造成的。TXNIP的降解依賴于TXNIP的C端PPXY結(jié)構(gòu)與泛素等的結(jié)合，發(fā)生泛素化，并最終由蛋白酶體降解。Trx的32或35位半胱氨酸與TXNIP的247位半胱氨酸的結(jié)合可能引起TXNIP的C端PPXY結(jié)構(gòu)折疊，阻止其泛素化降解。而突變的C247S的TXNIP，可能是由于喪失與Trx的結(jié)合，穩(wěn)定性減弱，降解增加，造成其蛋白水平的降低。

通過對反映細(xì)胞損傷程度的LDH活性的測定，發(fā)現(xiàn)野生型組與點突變組均明顯升高，同時反映細(xì)胞凋亡的capase-3活性兩組也明顯增加。由于使用的是正常糖脂濃度的DMEM培養(yǎng)基，因此排除了由高糖、高脂對細(xì)胞的影響，可以確定這種損傷和凋亡是由上調(diào)的TXNIP本身所引起的。

TXNIP是目前已知的唯一一種內(nèi)源性的Trx結(jié)合抑制蛋白[3]。而Trx是一種巰基抗氧化蛋白，由于其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量高，而且可借助NADPH和Trx還原酶的作用重新還原不斷發(fā)揮抗自由基作用，因而在細(xì)胞的抗自由基損傷中發(fā)揮著重要作用[10]。我們首先使用免疫共沉淀方法反映TXNIP與Trx的結(jié)合程度。與空病毒組相比，野生型TXNIP過表達(dá)組二者的結(jié)合量明顯升高，而點突變TXNIP過表達(dá)組與空病毒組相比結(jié)合程度無明顯變化，提示C247S位點突變過表達(dá)的TXNIP不能與Trx相結(jié)合。通過測定Trx的活性和蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與空病毒組相比，野生型組Trx活性顯著降低，而點突變組Trx活性無明顯變化，綜合TXNIP與Trx結(jié)合程度的結(jié)果，說明TXNIP通過其247位的半胱氨酸與還原型的Trx的Cys32或Cys35結(jié)合[4]，進(jìn)而抑制其活性，而C247S突變的TXNIP確實失去了與Trx結(jié)合并抑制Trx功能的能力。Trx的蛋白表達(dá)量兩組均未見明顯變化，提示這種結(jié)合不影響Trx的蛋白表達(dá)。

從結(jié)構(gòu)來看，TXNIP是一種α-阻抑蛋白，通過其N端的阻抑蛋白樣結(jié)構(gòu)域可能與多種蛋白產(chǎn)生相互作用[11]，因此TXNIP可能存在抑制Trx以外的其他作用途徑。已有研究報道，TXNIP可抑制骨骼肌細(xì)胞[12]、成熟的脂肪細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞[13]的葡萄糖攝取，這些作用均與其對Trx的抑制作用無關(guān)。TXNIP通過何種不依賴于Trx結(jié)合抑制的途徑促進(jìn)凋亡，是否可以通過抑制胰島細(xì)胞葡萄糖攝取促進(jìn)細(xì)胞凋亡；同時糖尿病發(fā)病過程中機(jī)體產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，TXNIP是否通過炎性介質(zhì)影響凋亡，這些將在本實驗室后續(xù)的實驗中予以觀察。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，單純過表達(dá)TXNIP可以引起正常糖脂濃度培養(yǎng)條件下的胰島細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡。TXNIP介導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡的機(jī)制一方面與其抑制Trx活性、增加自由基損傷、增加ASK1-p38激酶依賴的凋亡途徑有關(guān)，同時也有不依賴結(jié)合抑制Trx的途徑存在。TXNIP的表達(dá)上調(diào)是糖尿病引起胰島細(xì)胞損傷和凋亡的重要原因。

圖1 轉(zhuǎn)染72 h胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

圖2 Real-time PCR方法測定轉(zhuǎn)染INS-1胰島細(xì)胞TXNIP的mRNA表達(dá)

圖3 -1 Western Blot方法測定TXNIP蛋白表達(dá)

圖3 -2 Western Blot方法測定Trx蛋白表達(dá)

圖5 Trx活性測定

圖6 乳酸脫氫酶（LDH）活性的變化

圖7 caspase-3活性測定

圖8 p38激酶活性

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Effect of adenovirus-mediated TXNIP overexpression on apoptosis and injury of INS-1 islet cell

LIU Xiao-Bo，YANG Xiao，YAO Yan-Ling，et al.Department of Physiology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Objective To observe if TXNIP overexpression alone can cause islet cell apoptosis，Adenovirus carrying TXNIP gene was used to transfect INS-1 islet cells cultured in normal glucose and normal lipid concentration conditions.Meanwhile，adenovirus carrying a mutant C247S TXNIP gene，which lost its ability to attach and inhibit Trx by changing the cysteine at site 247 of TXNIP to serine，was also used to elucidate if TXNIP has additional effect on cell apoptosis independently of Trx.Methods INS-1 islet cells cultured in normal sugar conditions were randomly divided into four groups:normal cultured group，empty adenovirus vector group （AdeGFP），TXNIP overexpression group（Ad-TXNIP-eGFP）and C247S mutated TXNIP overexpression group.Results Compared with empty adenovirus vector group，TXNIP mRNA and protein expression level，the combination of Trx and TXNIP，LDH activity，caspase-3 activity and p38 kinase activity in TXNIP overexpression group were significantly increased，while the Trx activity decreased significantly.In C247S mutated TXNIP overexpression group，parameters such as TXNIP mRNA and protein expression level，LDH activity，caspase-3 activity were also signifi－cantly increased，however，the combination of Trx and TXNIP，Trx activity，p38 kinase activity were not changed.Compared with TXNIP overexpression group，C247S mutated TXNIP overexpression group showed increased Trx activity and decreased combination of Trx and TXNIP and p38 kinase activity.Conclusion These results suggested that TXNIP overexpression can induce severe apoptosis and injury in islet cell even they are cultured in normal glucose and normal lipid concentration conditions.The mechanism involved is that TXNIP can bind and inhibit Trx，thus impaired its antioxidative and antiapoptotic function，and then enhanced free radical induced injury and p38 kinase dependent cell apoptosis.Trx independent pathway may also participated since C247S mutated TXNIP cannot bind to and inhibit Trx and have no effect on p38 kinase activity induced cell apoptosis.

Thioredoxin； Thioredoxin-interacting protein； Islet cells； Apoptosis； Mutation

國家自然科學(xué)基金（項目編號：30800399）；山西省自然基金（項目編號：2014011049-12）;

山西省高等學(xué)校創(chuàng)新人才支持計劃；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（項目編號：2009-46)

03000l 山西省太原市，山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.12.019

R587.1

A

1672-5301（2014）12-1127－06

2014-10-11）