環(huán)氧化合物交聯(lián)明膠水凝膠的制備及表征

陳肖會，關(guān)國平，王 璐

東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海， 201620)

環(huán)氧化合物交聯(lián)明膠水凝膠的制備及表征

陳肖會，關(guān)國平，王 璐﹡

東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海， 201620)

目的明膠水凝膠因其良好的生物相容性而成為一種應(yīng)用前景很好的組織工程材料。該研究采用不同濃度的明膠，添加了適量的環(huán)氧化合物交聯(lián)劑聚乙二醇二縮水甘油醚(PGDE)，制備了不同的明膠水凝膠。紅外光譜顯示，PGDE以兩端開環(huán)的方式交聯(lián)到了明膠分子上。隨著明膠和交聯(lián)劑濃度的增大，水凝膠的溶脹率從1218.19%下降到525.23%，最大壓縮應(yīng)力顯著增大，從27.64 kPa增大到113.20 kPa，壓縮正切模量也從0.19 kPa增大到0.59 kPa，力學(xué)性能得到了明顯提高。PGDE交聯(lián)明膠水凝膠具有優(yōu)異的彈性回復(fù)性能，彈性回復(fù)率最高可達(dá)98.03%。溶血率試驗(yàn)結(jié)果表明，凝膠有良好的血液相容性。

明膠；水凝膠；PGDE; 化學(xué)交聯(lián)

0 引言

明膠是通過熱變性或者物理化學(xué)降解作用，將膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)裂解為單鏈大分子而獲得的[1]。明膠既保留了膠原蛋白的一些識別序列，使其既有利于細(xì)胞粘附、分化和生長，又表現(xiàn)出比膠原蛋白低的抗原性[2]，使得明膠成為理想的組織工程原材料。明膠水凝膠因其多孔的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，含有大量的水分，而與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu)相似，使得明膠水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性。然而，純明膠水凝膠的力學(xué)性能很差，體溫和液體環(huán)境下易溶于水，限制了其應(yīng)用范圍。

通過交聯(lián)作用可以提高明膠水凝膠的力學(xué)性能，降低溶脹率，增加降解時(shí)間，得到符合組織工程要求的生物材料。交聯(lián)劑的選擇很重要，明膠常用的交聯(lián)劑為戊二醛[3-4]、甲醛[5]、EDC(碳化二亞胺)[6]與京尼平[7]等。但是醛類有較強(qiáng)的毒性，其中戊二醛交聯(lián)明膠的細(xì)胞毒性為4級，而且易導(dǎo)致組織硬化、鈣化[8]，EDC和京尼平是近年來開始使用的交聯(lián)劑，價(jià)格比較昂貴。據(jù)報(bào)道，制備絲素凝膠材料采用的環(huán)氧化合物交聯(lián)劑聚乙二醇二縮水甘油醚(PGDE)的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于戊二醛，在醫(yī)用的合格范圍內(nèi)[9]，且材料柔韌性良好[10]。Moonsri等[11]采用PGDE作為交聯(lián)劑得到了力學(xué)性能良好的絲素膜。至今，未見關(guān)于PGDE交聯(lián)明膠水凝膠的文獻(xiàn)報(bào)道。本課題采用PGDE作為交聯(lián)劑，制備了化學(xué)交聯(lián)明膠水凝膠，并對其凝膠時(shí)間、力學(xué)性能、溶脹性能、分子交聯(lián)結(jié)構(gòu)和生物相容性進(jìn)行了測試和表征，為環(huán)氧化合物交聯(lián)明膠水凝膠的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

明膠，化學(xué)純CP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。氯化鈉，分析純AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。聚乙二醇二縮水甘油醚(PGDE，分子量526 g/mol)，美國Aldrich公司。其他所有化學(xué)試劑均為分析純AR。

1.2水凝膠的制備

稱取一定量的明膠，在50℃下溶解在蒸餾水中。然后向明膠水溶液中加入適量的PGDE、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的催化劑NaCl, 充分混合均勻，密封后快速放入60℃環(huán)境使其凝膠。制備方案如表1所示。

表1 水凝膠試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)(表中水凝膠試樣代號為G/P-[明膠%(w/w)]/[PGDE%(w/w)])Tab.1 Experimental design of hydrogel

1.3水凝膠的性能表征

1.3.1 凝膠時(shí)間

凝膠時(shí)間的測定以傾斜溶液90℃，沒有液體流出，且液面平整為準(zhǔn)。

1.3.2 分子結(jié)構(gòu)表征

為了確定水凝膠內(nèi)部交聯(lián)位點(diǎn)，水凝膠樣品在Nicolet 6700上進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜分析，波長范圍4 000～400 cm-1，采用ATR法進(jìn)行制樣。樣品處理過程如下：凝膠之后的樣品先在蒸餾水中浸泡72 h，每12 h換一次水，以除去未反應(yīng)物[12-13]。然后在-20℃預(yù)冷24 h，再真空冷凍干燥48 h得到干燥的樣品。

1.3.3 溶脹行為

水凝膠的溶脹性采用稱重法進(jìn)行表征。首先，水凝膠樣品放在磷酸鹽緩沖液PBS(pH=7.4)，37±1℃環(huán)境下放置24 h，然后把樣品從PBS中取出，用濾紙吸干表面的水分后稱重。樣品在-20℃預(yù)冷24 h，真空冷凍干燥48 h后稱取干重。溶脹率采用公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

式中W、W0分別為溶脹平衡的質(zhì)量(g)和冷凍干燥之后的質(zhì)量(g)。

1.3.4 力學(xué)性能

采用LLY-06D型人體內(nèi)生物管道壓縮彈性測試儀進(jìn)行水凝膠的力學(xué)性能測試。力學(xué)測試之前，水凝膠在PBS中浸泡24 h溶脹平衡，然后用手術(shù)刀切成一定的尺寸(10 mm×10 mm×6 mm)。具體測試步驟如下：(1)將試樣放在試樣臺上，試樣厚度記為L0；(2)以10 mm/min的速度對試樣進(jìn)行壓縮，至試樣厚度的90%，持續(xù)壓縮10 s，記錄最大壓縮強(qiáng)力及伸長值；(3)以10 mm/min的速度移除壓力，記錄外力完全移除后試樣的厚度，記為L；(4)每個(gè)樣品測試三次，壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線通過計(jì)算得到，其中測試頭直徑為5 mm，壓縮正切模量Etan選取20～30%應(yīng)變處的模量值[7]，彈性回復(fù)率R采用式(2)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

1.3.5 溶血試驗(yàn)

凝膠的溶血試驗(yàn)根據(jù)GB/T 16886[14]、ISO 10993[15]和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16]的方法進(jìn)行。陽性對照采用蒸餾水，陰性對照采用生理鹽水。首先，分別向試樣組和陰性對照組每個(gè)離心管中各加入生理鹽水10 mL，同時(shí)向陽性對照組每個(gè)離心管中加入蒸餾水10 mL，然后分別向試樣組每個(gè)離心管中加入水凝膠0.25 g。全部離心管浸入37℃水浴鍋平衡30 min。用移液槍取抗凝全血(人靜脈血+K2-EDTA) 2 mL，加入2.5 mL生理鹽水，輕輕搖晃均勻，得到稀釋的抗凝全血。向所有管子加入0.2 mL稀釋的抗凝全血，輕輕搖勻后放入37℃水浴鍋繼續(xù)保溫60 min。所有管子離心10 min(1000 r/min)。最后吸取上清液于比色皿中，分光光度計(jì)在545 nm處測吸光度值A(chǔ)。溶血率采用下面公式進(jìn)行計(jì)算：

(3)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1凝膠時(shí)間

明膠濃度和PGDE濃度與形成凝膠所需時(shí)間的關(guān)系，見圖1。從圖1可以看出，隨著明膠濃度的增大，凝膠時(shí)間縮短。同樣隨著PGDE濃度的增大，凝膠時(shí)間也明顯縮短。8% PGDE與4% PGDE對比，隨著明膠濃度的增大，前者凝膠時(shí)間縮短更快(圖中擬合方程中，8% PGDE斜率更大)。這可能是由于高濃度的明膠為PGDE提供了更多的交聯(lián)位點(diǎn)，使得交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行的更加順利。這比絲素溶液與PGDE的交聯(lián)反應(yīng)[10]快得多。此外，明膠溶液不加任何交聯(lián)劑，在29℃[7]以下都可以發(fā)生明膠分子之間的物理交聯(lián)，在4℃靜置十幾分鐘即可完全反應(yīng)。但是一旦溫度超過29℃便又溶解成水溶液。

圖1 明膠和交聯(lián)劑濃度對凝膠時(shí)間的影響 Fig.1 Influence of gelatin and crosslinking agent concentration on gelling time

2.2FT-IR

紅外光譜圖通過反映分子內(nèi)部的基團(tuán)振動，從而得知分子鏈構(gòu)成。如圖2所示，PGDE(c)在1108 cm-1出現(xiàn)烷醚鍵-CH2-O-CH2-不對稱伸縮振動所產(chǎn)生的特征吸收峰，對比明膠(a)，可知交聯(lián)水凝膠(b)新增了此特征吸收峰，證明PGDE與明膠發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，結(jié)合到了明膠分子上。PGDE在2869 cm-1、912 cm-1和856 cm-1處，出現(xiàn)環(huán)醚的特征吸收，交聯(lián)明膠水凝膠(b)沒有此特征峰，說明PGDE以兩端開環(huán)的形式交聯(lián)到了明膠分子中。另外，此處的交聯(lián)明膠水凝膠，事先用蒸餾水浸泡72 h以去除多余的PGDE，此處交聯(lián)水凝膠沒有出現(xiàn)PGDE兩端環(huán)醚的特征吸收峰，說明未反應(yīng)的交聯(lián)劑可以通過浸洗去除。比較圖2明膠(a)和交聯(lián)水凝膠(b)，在 1 635 cm-1和1 645 cm-1處均出現(xiàn)酰胺Ⅰ的特征吸收， 1 548 cm-1處均出現(xiàn)酰胺Ⅱ的特征吸收峰，說明明膠與PGDE發(fā)生化學(xué)交聯(lián)之后，仍保留其酰胺結(jié)構(gòu)。

圖2 紅外光譜圖(a)明膠 (b)交聯(lián)水凝膠(G/P-8/8) (c)PGDEFig.2 FT-IR spectra of (a)gelatin (b)cross-linked hydrogel(G/P-8/8) (c)PGDE

2.3溶脹率

水凝膠的高溶脹度有利于細(xì)胞的粘附、生長，可防止體液和營養(yǎng)物質(zhì)的流失[17]。從圖3中可以看出，隨著明膠濃度的增大，水凝膠的溶脹率下降。PGDE濃度為8%時(shí)，當(dāng)明膠濃度從8%增加到16%時(shí)，其溶脹率從1 218.19%下降為778.17%。這一方面是因?yàn)殡S著明膠濃度的增大，分子內(nèi)部物理交聯(lián)增多，結(jié)構(gòu)更緊密，阻礙了水分子的滲透。另一方面，更多的明膠分子提供了更多的基團(tuán)參與交聯(lián)反應(yīng)，增大了水凝膠的交聯(lián)度，使得結(jié)構(gòu)更加致密[18]。

圖3 明膠和交聯(lián)劑濃度對水凝膠試樣溶脹率的影響Fig.3 Influence of gelatin and crosslinking agent concentration on swelling ratio of hydrogel sample

比較圖3中兩條曲線可以發(fā)現(xiàn)，隨著交聯(lián)劑濃度的增大，溶脹率下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。說明交聯(lián)反應(yīng)使得明膠水凝膠的結(jié)構(gòu)更加致密了。水凝膠的溶脹率與交聯(lián)密度、滲水率、孔隙尺寸有直接關(guān)系[19]。改善水凝膠的溶脹行為能夠影響其孔隙尺寸和力學(xué)性能[20]。

2.4力學(xué)性能

化學(xué)交聯(lián)明膠水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖4所示，從圖4可以看到，凝膠有優(yōu)異的回彈性。具體壓縮指標(biāo)如表2所示，隨著交聯(lián)劑濃度的增大，水凝膠的正切模量Etan增大，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[7]。這可以解釋為高濃度的交聯(lián)劑提供了更多的交聯(lián)位點(diǎn)，使得水凝膠內(nèi)部交聯(lián)密度增大，即水凝膠剛性增加。不難發(fā)現(xiàn)，隨著交聯(lián)劑濃度的增大，最大壓縮應(yīng)力σmax顯著增大，原因可能是隨著PGDE濃度的增大，交聯(lián)位點(diǎn)增多，交聯(lián)密度增大，需要更大的力才可以變形到設(shè)定值。此外可以看到，隨著明膠濃度的增大，壓縮正切模量Etan增大，最大壓縮應(yīng)力σmax也增大，這是因?yàn)槊髂z濃度的增大，使得水凝膠整體密度增大， 高聚物纏結(jié)更加緊密，結(jié)構(gòu)更加致密，水凝膠更加堅(jiān)韌，不易變形。PGDE交聯(lián)明膠水凝膠的σmax值與京尼平[7]交聯(lián)明膠水凝膠、EDC[17]交聯(lián)明膠水凝膠在相同的數(shù)量級內(nèi)?？梢钥吹诫S著明膠和PGDE濃度的增大，水凝膠的最大壓縮應(yīng)力σmax顯著增大，從27.64 kPa增大到113.20 kPa，壓縮正切模量Etan也從0.19 kPa增大到0.59 kPa，這和水凝膠溶脹行為的結(jié)果相吻合，即明膠和PGDE濃度越高，結(jié)構(gòu)越致密，水分子越不易滲入，溶脹率越低，水凝膠強(qiáng)力越高。明膠水凝膠的彈性回復(fù)率R相當(dāng)高，最高可達(dá)98.03%，這可能跟交聯(lián)明膠水凝膠有相當(dāng)致密的均勻多孔結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖4 壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線(圖中水凝膠試樣為G/P-16/8)Fig.4 Compressive stress-strain curves (obtained for sample G/P-16/8)

表2 明膠水凝膠試樣的力學(xué)性能Tab.2 Mechanical properties of gelatin hydrogel sample

2.5血液相容性

溶血實(shí)驗(yàn)是血液相容性的主要評價(jià)方法。溶血率的測定是通過檢測材料與血液直接接觸過程中，紅細(xì)胞破裂所釋放血紅蛋白及紅細(xì)胞素的量，來表征材料的體外溶血程度。材料的溶血率高，說明對紅細(xì)胞的破壞程度大。溶血率小于5%，符合醫(yī)用材料的溶血率試驗(yàn)要求。G/P-12/4試樣的溶血試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，由表中數(shù)據(jù)可知凝膠的溶血率1.209 4%小于5%，符合醫(yī)用材料的溶血率試驗(yàn)要求。

表3 溶血率測試結(jié)果Tab.3 Results of hemolysis test

3 結(jié)論

本課題研究顯示環(huán)氧化合物PGDE能夠成功地交聯(lián)明膠，且未反應(yīng)的交聯(lián)劑可以通過浸洗去除，排除凝膠上殘留PGDE對生物相容性的不良影響。本研究制得的水凝膠，具有優(yōu)異的彈性回復(fù)性，且隨著明膠和交聯(lián)劑濃度的增大，水凝膠結(jié)構(gòu)更加致密，水分子不易滲入，溶脹率減小，最大壓縮應(yīng)力增大，因此我們可以通過適當(dāng)調(diào)整明膠和PGDE的濃度來獲得力學(xué)性能良好的水凝膠材料。材料的血液相容性良好，可以預(yù)測其具有良好的生物性能。在提高其力學(xué)性能的同時(shí)，仍保留了良好的生物相容性，PGDE交聯(lián)明膠水凝膠有望成為理想的組織工程材料。

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PreparationandCharacterizationofGelatinHydrogelwithEpoxideasCrosslinkingAgent

Chen Xiaohui, Guan Guoping, Wang Lu*

Key Laboratory of Textile Science & Technology, Ministry of Education, Donghua University, (Shanghai, 201620)

Gelatin hydrogel is a promising tissue engineering material due to its good biocompatibility. In this study, several components of gelatin hydrogels were prepared with certain concentrations of gelatin and cross-linking agent epoxide polyethylene glycol diglycidyl ether (PGDE). FT-IR spectrum showed that PGDE was induced onto gelatin chains by opening the rings on both sides. As the concentrations of gelatin and cross-linking agent increased, swelling ratio of hydrogel declined from 1 218.19% to 525.23%, compressive stress at failure increased significantly from 27.64 kPa to 113.20 kPa，compressive tangent modulus also increased from 0.19 kPa to 0.59 kPa., indicating the mechanical properties were improved obviously. The PGDE cross-linked gelatin hydrogel had excellent elastic resilience, the highest elastic recovery was 98.03%. And that the hydrogel also has good blood compatibility, as indicated in the hemolysis test.

gelatin, hydrogel, polyethylene glycol diglycidyl ether(PGDE), chemical cross-linking

10.3969/j.issn.1674-1242.2014.01.004

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51003014)

陳肖會，碩士研究生，研究方向：天然蛋白質(zhì)水凝膠

王璐, E-mail: wanglu@dhu.edu.cn

R318

A

1674-1242(2014)01-0018-05

2013-11-11)