紅景天聯(lián)合順鉑協(xié)同誘導(dǎo)人肺腺癌耐藥細(xì)胞的凋亡

黎 萍 于文暢 鄭百紅 李君瑤 張 捷

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院兒科， 吉林 長(zhǎng)春 130041)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的75%～80%，其中70%以上的NSCLC確診時(shí)為中晚期〔1，2〕。以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療在其綜合治療中占有重要地位，但鉑類的耐藥嚴(yán)重地影響了其臨床療效〔3〕。多種天然植物具有抗癌作用，且副作用較小〔4〕。紅景天提取自中草藥紅景天根，具有廣泛的藥理作用〔5〕。研究證實(shí)，紅景天能抑制肝癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡〔6, 7〕。順鉑是鉑類藥物中最經(jīng)典、最具代表性的藥物；凋亡耐受是腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制之一〔8〕，紅景天能否通過誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡，協(xié)同順鉑對(duì)肺腺癌耐藥細(xì)胞的發(fā)揮生長(zhǎng)抑制、凋亡誘導(dǎo)的作用，從而增強(qiáng)肺腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性？目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬觀察紅景天聯(lián)合順鉑對(duì)人肺腺癌A549/DDP耐順鉑細(xì)胞株的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要材料 人肺腺癌細(xì)胞株A549及其耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，兩個(gè)細(xì)胞株均在RPMI1640培養(yǎng)液(含10%新生牛血清)中，37℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。A549/DDP在1 μg/ml順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d以上以維持耐藥性。MTT、順鉑、胰酶、RPMI1640培養(yǎng)基均購自碧云天生物科技有限公司；caspase3、聚腺苷二磷酸-核糖(PARP)抗體一抗購自Santa-cruz公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自武漢博士德公司。

1.2MTT法檢測(cè)紅景天、順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制 將A549/DDP細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。紅景天組細(xì)胞加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/ml梯度濃度的紅景天，順鉑組加入80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/ml濃度梯度順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入150 μl的DMSO振蕩10 min溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度(OD570 nm)值，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率的數(shù)值(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率 調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×106接種于培養(yǎng)皿中，設(shè)對(duì)照組、紅景天組、順鉑組及紅景天+順鉑組，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，取適宜濃度的紅景天、順鉑作用于A549/DDP細(xì)胞24、48、72 h后，收集細(xì)胞，Annxni-V和PI染色后，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.4Western印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞的總蛋白，行蛋白定量后，取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)，封閉，加入人酶切caspase3、酶切PARP一抗雜交，再加入二抗，按ECL試劑盒說明書發(fā)光、曝光。以β-actin為內(nèi)參照，以目的蛋白的相對(duì)光密度值間接表示蛋白含量。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。用1.8 mg/ml紅景天作用于A549/DDP細(xì)胞12、24、48 h，用Annexin-V和PI進(jìn)行染色后，用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，采用線性回歸計(jì)算紅景天及順鉑作用于A549/DDP細(xì)胞的IC50。兩組間比較采用t檢驗(yàn)；采用One-Way ANOVA分析多組間比較，采用LSD法行組間兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1A549/DDP對(duì)順鉑耐藥性 順鉑作用A549/DDP 24 h的 IC50為(36.41±4.14)μg/ml，而A549細(xì)胞的IC50為(7.98±1.23)μg/ml，和A549細(xì)胞比，等量的順鉑對(duì)A549/DDP抑制作用有限，該結(jié)果表明A549/DDP對(duì)順鉑明顯耐藥。

2.2聯(lián)合應(yīng)用紅景天及順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制率 紅景天、順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用，并呈濃度依賴性。見表1和表2。紅景天對(duì)A549/DDP細(xì)胞作用24 h的IC50為(1.91±0.32)mg/ml，48 h的IC50為(1.24±0.27)mg/ml。6.0 μg/ml順鉑、1.8 mg/ml紅景天和二者聯(lián)合作用于A549/DDP細(xì)胞，24 h后抑制率分別為：(24.88±3.72)%、(24.69±1.73)%及(54.6+2.95)%，紅景天+順鉑組與另外兩組差異顯著(F=69.63，P<0.001)。

表1 順鉑對(duì)人肺腺癌細(xì)胞抑制率的影響±s,n=3,%)

表2 不同濃度紅景天24、48 h對(duì)A549/DDP細(xì)胞抑制率的影響±s,n=3,%)

2.3聯(lián)合應(yīng)用紅景天及順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡率的影響 藥物作用24 h后，順鉑組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；紅景天組細(xì)胞凋亡率均明顯低于聯(lián)合用藥組(P<0.05)。見表3。

2.4聯(lián)合應(yīng)用紅景天及順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 各組細(xì)胞蛋白電泳結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白酶切caspase 3以及酶切PARP表達(dá)明顯增加，見圖1。

表3 各組A549/DDP細(xì)胞的凋亡率±s，n=3,%)

圖1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白電泳圖

3 討 論

紅景天為多年生草本或亞灌木野生植物，藥理學(xué)研究表明其主要藥理活性成分為紅景天苷〔5〕。紅景天對(duì)腫瘤的抑制作用國內(nèi)外均有報(bào)道〔7, 9〕。紅景天在體外對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞具有顯著的抑制作用〔6〕；本研究顯示，紅景天可明顯增強(qiáng)順鉑對(duì)人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP的生長(zhǎng)抑制與凋亡促進(jìn)作用。

順鉑通過多種機(jī)制發(fā)揮抗癌作用，目前已經(jīng)明確的最重要的機(jī)制是順鉑通過引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷，并激活凋亡信號(hào)發(fā)揮作用。本研究表明，A549/DDP對(duì)順鉑具有一定耐藥性，聯(lián)合應(yīng)用紅景天、順鉑對(duì)A549/DDP 細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用明顯增強(qiáng)。已有報(bào)道表明，紅景天可能通過干擾細(xì)胞代謝、改變細(xì)胞外衣的性質(zhì)抑制肺腺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)〔10〕。本研究中，紅景天能抑制肺腺癌耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)，紅景天對(duì)A549/DDP的抑制作用呈時(shí)間依賴性、濃度依賴性。1.8 mg/ml紅景天可以顯著增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞的凋亡發(fā)生，且作用呈時(shí)間依賴性。凋亡執(zhí)行蛋白caspase3以及其作用底物聚(ADP-核糖)PARP分別通過裂解成酶切caspase3及酶切PARP發(fā)揮凋亡執(zhí)行功能。另有研究表明，紅景天可能通過增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤的生長(zhǎng)〔11〕。

綜上，紅景天與順鉑有協(xié)同作用，二者聯(lián)合對(duì)多藥耐藥肺癌細(xì)胞的增殖抑制、凋亡促進(jìn)的作用顯著加強(qiáng)；紅景天能增強(qiáng)肺癌抗腫瘤免疫應(yīng)答〔11〕。

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