內質網(wǎng)應激相關蛋白在大鼠急性脊髓損傷中的表達及其意義

田小磊 王 坤 靳安民

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510282)

脊髓損傷(SCI)可造成患者功能障礙并留下終生殘疾，目前關于SCI的治療和愈合護理尚存在爭議，故對于如何最大限度降低患者殘疾程度，恢復其脊髓功能在醫(yī)學界成為研究熱點〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)，SCI不但能造成細胞壞死，同時能造成細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象，從而影響脊髓的相關功能〔3〕。過去認為細胞凋亡的主要途徑為線粒體途徑和死亡受體途徑〔4〕，如今在一些研究中發(fā)現(xiàn)，內質網(wǎng)應激(ERS)也能造成細胞凋亡，其中轉錄因子(C/EBP)家族中的CHOP/GADD153是特異的ERS轉錄因子〔5〕。本研究通過觀察大鼠急性SCI前后其脊髓組織中內質網(wǎng)應激相關蛋白(CHOP)的表達情況以及神經(jīng)細胞的凋亡變化，從而進一步探討ERS激對于急性SCI的意義。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取56只6～8周齡健康 SD 大鼠 (湖南省人民醫(yī)院動物實驗室提供)，雌雄各半，體重 320～400 g。隨機分為對照組和實驗組，每組28只，按損傷時間點將每組分為3、24 h、3、7 d四組(每組7只)，每組均在脊髓損傷后計算時間，并于相應時間點進行神經(jīng)功能Tarlov評分，而后處死動物進行心臟灌注和組織觀測試驗。

1.2建立動物模型 以Allen法作為參照制作脊髓損傷大鼠模型。實驗組制作方法：(1)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.1 ml/kg)麻醉大鼠后，固定大鼠四肢及門牙于解剖板上；(2)剪凈大鼠胸背部T10處及其周圍4 cm2面積的毛，使其皮膚組織暴露；(3)用3%絡合碘進行皮膚消毒，在T10水平背部正中線做2～3 cm縱行切口，依次切開皮膚、筋膜，并可見白色腱膜；(4)剝離棘突兩側的肌肉暴露T9～T11棘突和椎板；(5)切除T9、T10椎板，暴露硬膜囊范圍約1.0×0.4 cm2大?。?6)用10 g質量的條形金屬撞擊器控制2.5 cm高度在導向器內做自由落體打擊導向器底部，導向器嘴部撞擊硬膜囊致脊髓中度損傷，若大鼠尾巴和后肢發(fā)生抽搐，則急性SCI大鼠模型制作成功；(7)逐層關閉切口，以敷料覆蓋傷口并固定，單籠飼養(yǎng)；(8)每天每只大鼠以青霉素和慶大霉素聯(lián)合抗感染，生存時間長于3 d者共給藥3 d，并輔以人工排尿、排便及清理傷口等處理。 對照組的大鼠只做T9、T10椎板切除術，不進行脊髓撞擊，其余處理與實驗組相同。

1.3評定神經(jīng)功能 分別于術后3、24 h、3、7 d觀察實驗組和對照組大鼠后肢運動情況，參照改良 Tarlov 標準進行評分：0分，后肢無主動活動；1分，后肢可小范圍活動，無行走能力；2分，后肢活動頻繁或有力、無行走能力；3分，可行走，步態(tài)嚴重障礙；4 分，可行走，步態(tài)輕度障礙；5分，可正常行走。

1.4心臟灌注和組織觀測 (1)心臟灌注：①分別在相應時間點各取7只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.1 ml/kg) 麻醉大鼠后固定于解剖板，打開大3鼠胸腔暴露心臟；②用止血鉗牽拉，將7號半輸液器針頭插入大鼠左心房直至主動脈內，剪開右心耳；③將生理鹽水100 ml快速灌注大鼠心臟，控制流速確保血管不鼓破；④用4%多聚甲醛快速灌注約15 min后，控制滴速(20 滴/min)再灌注3 h。(2)組織提?。孩僖訲8～T10為中心，取2 cm左右的損傷節(jié)段脊柱，仔細咬去椎板、椎體和周圍瘢痕組織，剝離除完整的脊髓組織；②將磷酸緩沖液清洗脊髓組織，于4%多聚甲醛中進行固定保存。 (3)組織學觀察：①用石蠟常規(guī)包埋，于損傷中心部位連續(xù)切片5張，5 μm厚；②隨機抽取2張切片均進行免疫組織化學染色；③采用HPIAS-1000圖像分析系統(tǒng)，于高倍鏡下隨機選擇5個視野，測定累積光密度IOD，取其平均值。

1.5缺口原位末端標記法(TUNEL) 染色 隨機抽取1張脊髓損傷組織切片進行TUNEL染色。染色方法：(1)將切片脫蠟入水，在室溫下用3%H2O2處理10 min，0.01 mol/L磷酸緩沖液清洗1次，在溫度37℃下用1∶200 蛋白酶 K消化10 min，于200 ml 0.1 mol 檸檬酸鈉的濕盒中放置切片；(2)用微波修復5 min，0.01 mol/L磷酸緩沖液清洗2次；(3)在切片中滴加脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)及標記液(TUNEL 試劑盒來自Roche公司 )；(4)在熒光顯微鏡激發(fā)強度為450～500 nm下觀察其熒光表達(綠光，波長為515～565 nm)；(5)在40倍鏡下采集圖像，若發(fā)出綠色熒光，說明為陽性細胞，且每張切片選取5個視野進行觀察，可用平均光密度描述細胞凋亡的情況。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件，7 d時點組進行兩因素重復測量分析；實驗組進行單因素方差分析；CHOP 表達和細胞凋亡資料進行兩因素析因方差分析；重復測量分析中的精細多次比較，按Bonferroni校正法進行顯著性水平α’的調整。

2 結 果

2.1神經(jīng)功能改良Tarlov評分 術后實驗組大鼠出現(xiàn)了不同程度的后肢運動功能障礙，而對照組各大鼠均未見明顯運動功能損害。見表1。整體分析發(fā)現(xiàn)：兩組4時點間，組別與時間的交互作用等均有顯著性意義(P<0.05)。再進行精細比較，在各個時間點，兩組間的差異均顯著(P<0.05)；經(jīng)配對t檢驗，僅實驗組的3 d和3 h兩時點比較有統(tǒng)計意義(P<0.05)，其他時點間比較均不顯著。實驗組大鼠后肢運動功能障礙在3 d時最明顯，另外各時間點對照組大鼠改良Tarlov評分均高于實驗組，且實驗組大鼠與對照組改良Tarlov評分差別均較大。

表1 7 d時點組大鼠急性SCI后不同時間點改良Tarlov評分±s,n=7)

考慮到Tarlov評分觀測，都是在大鼠被處殺前，4個時間組分別進行了1～4次評分觀測，這些多次評分尤其是實驗組的多次評分，都攜有不可忽略的試驗信息，此數(shù)據(jù)的重復測量性質已被弱化，故按4個時間獨立組進行分析(單因素方差分析)。3 h：3.82±0.51,1 :3.37±0.54,3 d：2.32±0.62,7 d:3.43±0.50。分析結果為：整體分析為顯著性差異(P<0.05)，兩兩比較也均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2組織學檢查 對照組大鼠急性SCI組織切片中未見明顯壞死細胞與凋亡細胞。 實驗組當時間在3 h時大鼠脊髓組織主要以壞死細胞為主，并出現(xiàn)血腫、脂肪液化、細胞核碎裂、細胞溶解現(xiàn)象，當時間在1 d 時出現(xiàn)較明顯凋亡細胞，并伴有神經(jīng)細胞固縮以及凋亡小體，3 d時凋亡細胞更多，但7 d時凋亡細胞數(shù)則有所降低。

2.3CHOP 表達情況 整體比較：兩個組間，4個時點間，分組及時間的交互作用均顯著(P<0.05)，提示CHOP水平兩組不同，4個時點間不同，各組隨時間的變化情況不同。見表2。

表2 各組大鼠急性SCI后不同時間點CHOP(累積光密度)表達±s,n=7)

結合數(shù)據(jù)來看：對照組大鼠急性SCI組織切片中免疫陽性細胞表達不明顯。實驗組在3 h后就有CHOP表達，SCI后1 d時CHOP表達雖有所升高，但與3 h相比差別不大；SCI 3 d時CHOP表達達到高峰，7 d時又有所下降，且SCI 1 d和7 d時CHOP的表達均與3 d時差別明顯。另外，各時間點實驗組CHOP表達與對照組均有較大差別。

2.4細胞凋亡情況 分析結果顯示：整體比較，兩個組間，4個時點間，分組及時間的交互作用差異顯著(P<0.05)，提示CHOP水平兩組不同，4個時點間不同，各組隨時間的變化情況不同。見表3。

結合數(shù)據(jù)來看：實驗組3 h時細胞凋亡情況與對照組差別不明顯，而1 d、3 d、7 d時兩組細胞凋亡均具有較大差別；實驗組3 h和1 d之間、1 d和3 d之間，3 d和7 d之間細胞凋亡均差別較大，其中3 d時細胞凋亡最為明顯。

表3 各組大鼠急性SCI后不同時間點TUNEL(平均光密度)表達±s,n=7)

2.5CHOP 表達與細胞凋亡的相關性 CHOP表達與細胞凋亡情況，在時間上兩者的趨勢表現(xiàn)相似，均于SCI 3 d后達到高峰。兩組相關分析得到 Pearson相關系數(shù)為0.729，且P=0.040，說明CHOP的表達與細胞凋亡具有直線相關。

3 討 論

SCI因能夠使患者發(fā)生功能障礙并造成終生殘疾，嚴重影響了患者生活質量，降低了勞動生產(chǎn)率，增加了家庭和社會的負擔〔6〕。一般情況下，SCI可以分為原發(fā)性SCI和繼發(fā)性SCI。原發(fā)性SCI是由于機械性外力造成脊髓組織被破壞造成出血、壞死等損傷，而繼發(fā)性SCI是在原發(fā)性SCI后，由于組織損傷部位及附近部位發(fā)生缺血再灌注損傷、脂質過氧化、興奮性神經(jīng)遞質損傷、產(chǎn)生炎癥介質、發(fā)生神經(jīng)細胞凋亡等一系列生理病理變化而造成的SCI〔7〕。SCI的最終結局不僅與原發(fā)性損傷有關，同時還跟繼發(fā)性損傷有直接聯(lián)系。關于繼發(fā)性損傷的機制目前尚不明確，一直是醫(yī)學研究中的難題，通過物理或藥物等人工干預方法進行治療和護理，對于患者功能障礙的恢復及提高其生活自理能力具有重要意義〔8〕。

細胞凋亡是在病理條件下細胞內發(fā)生的一種程序性細胞死亡，目前有研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡能嚴重影響SCI后的神經(jīng)功能，是造成脊髓發(fā)生繼發(fā)性損傷的主要因素〔3〕。過去認為細胞凋亡的主要有兩種途徑即線粒體途徑和死亡受體途徑，如今在一些研究中發(fā)現(xiàn)，ERS也能造成細胞凋亡〔9〕，其中轉錄因子C/EBP家族中的CHOP/GADD153是特異的ERS轉錄因子〔10〕。

內質網(wǎng)是真核細胞中非常重要的一種細胞器，包括鈣離子的調節(jié)、蛋白質的加工合成等。內質網(wǎng)中具有多種酶，且能對機體狀態(tài)進行即時監(jiān)控，當各種生理病理原因導致內質網(wǎng)功能發(fā)生變化時，內質網(wǎng)將進行對應應答反應即ERS反應。內質網(wǎng)發(fā)生應激反應的主要標志是在內質網(wǎng)內應激蛋白的誘導表達，包括內質網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)、GRP94和協(xié)調因子153(GADD153)。當GRP78和GADD153表達升高說明細胞發(fā)生了ERTS〔11〕。若應激強度過強及時間過長使內質網(wǎng)處于病態(tài)狀態(tài)導致其功能難以修復，從而能促使C反應蛋白(CRPs)、蛋白質折疊酶以及鈣網(wǎng)蛋白等物質形成增加以增強細胞的耐受能力〔12〕。若存在持續(xù)嚴重的內質網(wǎng)應激時，機體能使一些促凋亡因子如caspase-12、CHOP/GADD153表達，激活內質網(wǎng)凋亡途徑，從而造成細胞的凋亡和組織的損傷。

綜上所述，急性SCI早期主要表現(xiàn)為細胞壞死，后期細胞凋亡數(shù)增多。急性SCI能促使內質網(wǎng)發(fā)生應激，同時能夠增加促凋亡因子CHOP的表達。CHOP表達水平早期時比較低，3 d時CHOP表達水平明顯升高，引起細胞凋亡數(shù)也增多，CHOP表達水平與細胞凋亡具有直線相關關系。

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