帕金森病模型大鼠背內(nèi)側(cè)前額葉皮層錐體神經(jīng)元電活動(dòng)及5-羥色胺1A受體敏感性變化

王 爽 高 捷 蘇興利 郭玉芳 霍 健 王 湘

(西安醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，陜西 西安 710021)

帕金森病(PD)非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀已經(jīng)被證實(shí)與內(nèi)側(cè)前額葉皮層(mPFC)以及腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)遞質(zhì)系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)〔1〕。神經(jīng)解剖學(xué)證實(shí)腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA)發(fā)出的多巴胺(DA)能神經(jīng)纖維可以支配mPFC，尤其是背內(nèi)側(cè)前額葉皮層中錐體神經(jīng)元的活動(dòng)〔2〕。VTA通過(guò)對(duì)錐體神經(jīng)元的神經(jīng)支配，完成對(duì)工作記憶和認(rèn)知等大腦高級(jí)功能的調(diào)控。另外，背內(nèi)側(cè)前額葉皮層還接受來(lái)源于中腦縫核(RN)的5-HT神經(jīng)纖維支配，并對(duì)背內(nèi)側(cè)前額葉皮層中錐體神經(jīng)元的活動(dòng)起重要的調(diào)節(jié)作用〔3〕。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在用6-OHDA損毀SNc方法制作的中晚期PD模型大鼠中，除SNc中的DA能神經(jīng)元98%以上的損毀外，VTA中的DA能神經(jīng)元也有40%左右的丟失或損毀〔4〕。而且，黑質(zhì)紋狀體通路的變性能夠?qū)е?-HT受體表達(dá)的異常，并能夠使紋狀體、海馬和縫核中5-HT的含量顯著降低〔5〕。本研究探討PD狀態(tài)下，大鼠背內(nèi)側(cè)前額葉皮層中錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)，以及5-HT1A受體敏感性的改變情況。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物和藥品 雄性SD大鼠23只，體重240～330 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水。大鼠隨機(jī)分為2組：假手術(shù)組(n=17)和PD組(n=29)。6-OHDA，8-OH-DPAT，WAY100635和地昔帕明均購(gòu)自Sigma公司。

1.2PD模型大鼠的行為學(xué)檢測(cè) 采用6-OHDA化學(xué)性毀損單側(cè)SNc中的DA能神經(jīng)元，建立PD大鼠模型。術(shù)后第2周給大鼠頸部皮下注射阿撲嗎啡(0.05 mg/kg)，觀察大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。若大鼠在藥物注射后1～15 min出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)速度每1 min大于6圈，并且5 min內(nèi)超過(guò)20圈者，表明PD模型成功。不出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、向患側(cè)旋轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)總?cè)?shù)不足者則視為模型不成功，予以淘汰。

1.3電生理學(xué)記錄和放電形式的分析 電生理學(xué)記錄在SNc損毀后第3周進(jìn)行。采用玻璃微電極細(xì)胞外記錄法記錄錐體神經(jīng)元的放電，電極尖端直徑1～2 μm，阻抗10 - 20 MΩ，充灌液為0.5 mol/L醋酸鈉含2%滂胺天藍(lán)。細(xì)胞放電經(jīng)MEZ-8301微電極放大器，顯示于VC-11記憶示波器，以觀察電位波形、頻率和細(xì)胞放電的形式，同時(shí)信號(hào)輸入監(jiān)聽(tīng)器監(jiān)聽(tīng)。將信噪比大于3∶1的、穩(wěn)定的單細(xì)胞放電經(jīng)生物電信號(hào)采集與分析系統(tǒng)(CED1401 Spike2)輸入計(jì)算機(jī)后，作實(shí)時(shí)觀察、儲(chǔ)存和進(jìn)行頻率及放電形式的分析。采樣時(shí)間10～20 min。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)大鼠的心電，直腸溫度維持在(37± 0.5)℃。

1.4局部給藥 用雙管玻璃微電極(記錄電極和給藥電極)記錄mPFC中錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)，當(dāng)記錄到錐體神經(jīng)元自發(fā)放電后，穩(wěn)定10 min，通過(guò)給藥電極給予8-OH-DPAT溶液100 μl，含8-OH-DPAT 5 μg。一般情況下，微量注射會(huì)引起神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环鹊妮p微降低，這種作用持續(xù)約1 min。在統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)，微量注射后1 min內(nèi)的放電活動(dòng)不予計(jì)算。每只大鼠只觀察1個(gè)神經(jīng)元對(duì)藥物的反應(yīng)。

1.5錐體神經(jīng)元確認(rèn) mPFC中錐體神經(jīng)元通常表現(xiàn)為緩慢的自發(fā)放電，頻率0.1～5 Hz；動(dòng)作電位的波寬> 1 ms；呈現(xiàn)不規(guī)則或爆發(fā)式的放電形式〔6〕。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行配對(duì)t和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠電生理學(xué)記錄 假手術(shù)組大鼠錐體神經(jīng)元放電頻率為(0.52±0.10) Hz(n=22)，放電范圍：0.12～1.62 Hz，平均ISI為(4 184.79±741.53)，變異系數(shù)為(0.78±0.05)。PD組大鼠錐體神經(jīng)元放電頻率為(1.25±0.20) Hz(n=38)，放電范圍：0.1～2.52 Hz，與假手術(shù)組相比顯著升高(P<0.001)，平均ISI為(1 645.70±519.91)，與假手術(shù)組相比顯著降低(P<0.001)，變異系數(shù)為(1.10±0.06)，與假手術(shù)組相比顯著增高(P< 0.001)。

2.2各組大鼠放電形式 假手術(shù)組大鼠錐體神經(jīng)元呈現(xiàn)兩種不同的放電形式，不規(guī)則放電為81.82%，爆發(fā)式放電為18.18%。PD組大鼠放電形式明顯趨向爆發(fā)式活動(dòng)，與假手術(shù)組大鼠相比，PD組大鼠不規(guī)則放電為44.44%，爆發(fā)式放電為55.56%，爆發(fā)式放電顯著增多(P<0.001)。

2.3各組神經(jīng)元電活動(dòng)比較 在假手術(shù)組大鼠，局部給予8-OH-DPAT(5 μg/100 ml生理鹽水)顯著抑制錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)，使錐體神經(jīng)元的放電頻率下降為給藥前的(25±4)%；且這種抑制作用可以背WAY100635(50 μg/kg，i.v.)完全反轉(zhuǎn)，放電頻率恢復(fù)為給藥前的(108±6)%，證明抑制作用是通過(guò)5-HT1A受體實(shí)現(xiàn)的。在PD組大鼠，相同劑量的8-OH-DPAT使錐體神經(jīng)元的放電頻率輕微升高至給藥前的(99±11)%。見(jiàn)表1。

表1 背內(nèi)側(cè)前額葉皮層中局部給予8-OH-DPAT對(duì)各組錐體神經(jīng)元放電頻率的影響±s)

3 討 論

6-OHDA損毀SNc后，背內(nèi)側(cè)前額葉皮層中錐體神經(jīng)元頻率升高、爆發(fā)式放電活動(dòng)增強(qiáng)可能和以下原因有關(guān)：第一，背內(nèi)側(cè)前額葉皮層主要接受VTA的DA能神經(jīng)纖維傳入，并且表達(dá)D1和D2受體。電或化學(xué)刺激VTA以及微電泳DA時(shí)，可以使得PFC錐體神經(jīng)元的自發(fā)電活動(dòng)受到抑制〔6〕。這種抑制作用可能是通過(guò)直接作用于突觸后D2受體或者間接作用于GABA能中間神經(jīng)元從而實(shí)現(xiàn)的。另外，Wang等〔7〕發(fā)現(xiàn)損毀大鼠的SNc后，VTA中的DA能神經(jīng)元平均丟失32%。而且，6-OHDA單側(cè)損毀內(nèi)側(cè)前腦束也會(huì)導(dǎo)致大鼠PFC中D1和D2受體表達(dá)減少。從這些研究可以推斷，6-OHDA損毀SNc導(dǎo)致VTA中 DA能神經(jīng)元的變性，使背內(nèi)側(cè)前額葉皮層錐體神經(jīng)元上DA受體表達(dá)減少，從而導(dǎo)致了錐體神經(jīng)元的去抑制。第二，背內(nèi)側(cè)前額葉皮層也接受來(lái)自DRN和MRN的5-HT神經(jīng)投射。而且，最近資料顯示，PFC中50%～60%的錐體神經(jīng)元和20%～30%的中間神經(jīng)元上有5-HT1A受體的表達(dá)〔8〕。刺激DRN和MRN可以通過(guò)激活5-HT1A受體而抑制mPFC中錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)。在mPFC中，微電泳5-HT和5-HT受體激動(dòng)劑也可以通過(guò)5-HT1A受體產(chǎn)生抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的猴子PD模型中，PFC中5-HT1A受體密度顯著降低〔9〕。解剖學(xué)和電生理學(xué)研究都強(qiáng)有力的說(shuō)明黑質(zhì)-紋狀體通路變性導(dǎo)致mPFC中5-HT1A受體表達(dá)下降，以及DRN和MRN中5-HT能神經(jīng)元過(guò)度興奮都可能導(dǎo)致錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)增強(qiáng)〔10〕。

綜上所述，mPFC中錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)受復(fù)雜的內(nèi)源性和外源性調(diào)節(jié)。因此，我們推測(cè)VTA中DA能神經(jīng)元的喪失、mPFC中DA含量降低和5-HT1A受體表達(dá)的減少，以及縫核5-HT能神經(jīng)元的過(guò)度興奮都對(duì)錐體神經(jīng)元電活動(dòng)的增強(qiáng)和呈現(xiàn)爆發(fā)式放電神經(jīng)元的比例增多起重要作用。另外，錐體神經(jīng)元具有非常廣泛的分支，爆發(fā)式放電活動(dòng)對(duì)錐體神經(jīng)元具有非常重要的意義，因?yàn)檫@可以增加動(dòng)作電位到達(dá)神經(jīng)末梢區(qū)域的可能性。因此，爆發(fā)式放電增多可能是一種代償作用。

6-OHDA損毀SNc后，背內(nèi)側(cè)前額葉皮層中局部應(yīng)用5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT并不能改變錐體神經(jīng)元的放電頻率可能和以下原因有關(guān)：在假手術(shù)組大鼠，局部應(yīng)用8-OH-DPAT顯著抑制錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)，并且可以被選擇性5-HT1A受體拮抗劑WAY100635反轉(zhuǎn)，表明5-HT1A受體參與了這一過(guò)程。這些結(jié)果與以往的文獻(xiàn)報(bào)道一致〔11〕。另外，5-HT1A受體廣泛存在于大鼠腦內(nèi)錐體細(xì)胞的胞體和(或)軸丘上，也表達(dá)于mPFC的GABA能中間神經(jīng)元上。在損毀大鼠局部應(yīng)用8-OH-DPAT并不能改變錐體神經(jīng)元的放電頻率。因此，DA能神經(jīng)元的損毀，降低了皮層內(nèi)5-HT1A受體影響錐體神經(jīng)元活動(dòng)的能力。局部應(yīng)用8-OH-DPAT不能改變錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)，說(shuō)明5-HT1A受體功能失調(diào)和(或)在此區(qū)域內(nèi)密度降低。

4 參考文獻(xiàn)

1Tolosa E，Compta Y，Gaig C.The premotor phase of Parkinson′s disease〔J〕.Parkinsonism Relat Disord，2007；13：S2-7.

2Millan MJ.Serotonin 5-HT2C receptors as a target for the treatment of depressive and anxious states：focus on novel therapeutic strategies〔C〕. Therapie(Paris)，2005；60(5)：441-60.

3Doder M，Rabiner EA，Turjanski N,etal.Tremor in Parkinson′s disease and serotonergic dysfunction：an 11C-WAY100635 PET study〔J〕. Neurology，2003；60(4):601-5.

4Wang S，Zhang QJ，Liu J,etal.The firing activity of pyramidal neurons in medial prefrontal cortex and their response to 5-HT1A receptor stimulation in a rat model of parkinson′s disease〔J〕.Neuroscience，2009；159(4):850-61.

5Ishihara L，Brayne C.A systematic review of depression and mental illness preceding Parkinson′s disease〔J〕.Acta Neurol Scand，2006；113(4):211-20.

6Tseng KY，O′Donnell P.Dopamine-glutamate interactions controlling prefrontal cortical pyramidal cell excitability involve multiple signaling mechanisms〔J〕.J Neurosci，2004；24(22)：5131-9.

7Wang Q，Wang PH，McLachlan C.Simvastatin reverses the downregulation of dopamine D1 and D2 receptor expression in the prefrontal cortex of 6-hydroxydopamine-induced Parkinsonian rats〔J〕.Brain Res，2005；1045(1-2)：229-33.

8Santana N，Bortolozzi A，Serrats J,etal.Expression of serotonin1A and serotonin2A receptors in pyramidal and GABAergic neurons of the rat prefrontal cortex〔J〕.Cereb Cortex，2004；14(10)：1100-9.

9Hajos M，Gartside SE，Varga V,etal.In vivo inhibition of neuronal activity in the rat ventromedial prefrontal cortex by midbrain-raphe nuclei：role of 5-HT1A receptors〔J〕.Neuropharmacology，2003；45(1)：72-81.

10Zhang X，Andren PE，Svenningsson P.Changes on 5-HT2 receptor mRNAs in striatum and subthalamic nucleus in Parkinson′s disease model〔J〕.Physiol Behav,2007；92(1-2):29-33.

11Tierney PL，Degenetais E，Thierry AM,etal.Influence of the hippocampus on interneurons of the rat prefrontal cortex〔J〕.Eur J Neurosci，2004；20(2)：514-24.