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    線粒體轉(zhuǎn)錄因子A參與軟骨細胞退變逆轉(zhuǎn)的機制

    2014-09-13 03:17:30梁月屏廖壯文呂浩然謝楚海
    中國老年學(xué)雜志 2014年20期
    關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)原代骨關(guān)節(jié)炎

    黃 彥 梁月屏 廖壯文 呂浩然 謝楚海

    (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科,廣東 廣州 510260)

    骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病〔1〕。關(guān)節(jié)軟骨細胞的過度凋亡是OA發(fā)病的重要病理機制,而軟骨細胞的凋亡與線粒體關(guān)系密切,線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)是線粒體轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的關(guān)鍵激活子,與細胞凋亡過程相逆〔2〕。本研究分析膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者、正常關(guān)節(jié)軟骨細胞的線粒體DNA特征和TFAM表達的差異情況,以期闡明TFAM與OA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1病例資料 選擇我院2011年10月至2012年10月的膝關(guān)節(jié)OA患者20例,入選OA組,同時設(shè)立因關(guān)節(jié)矯形等手術(shù)剩余的正常關(guān)節(jié)軟骨組織細胞20例。診斷標準:參照中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會制定的OA診治指南(2007年版)的診斷標準〔3〕。納入標準:①女性患者,絕經(jīng)1 年以上, 年齡55~65歲; ②符合上述的診斷標準; ③能夠收集到較為齊全的相關(guān)資料者并簽署知情同意書;④研究前患者均簽訂知情同意書。排除標準:①繼發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎患者;②6個月內(nèi)服用過影響骨代謝藥物的患者;③合并嚴重心、肝、腎以及其他系統(tǒng)疾病者,精神病及腫瘤患者;④不同意和配合進行研究的患者。

    1.2收集樣本和建立軟骨細胞的體外培養(yǎng)體系

    1.2.1關(guān)節(jié)軟骨的收集 取膝OA關(guān)節(jié)置換手術(shù)中取下關(guān)節(jié)軟骨。取下的軟骨組織置于含青霉素鈉/鏈霉素雙抗PBS液的無菌培養(yǎng)皿中,漂洗去除血細胞和關(guān)節(jié)滑液,清除滑膜組織。最后在含雙抗液的PBS液的無菌培養(yǎng)皿中用眼科剪將軟骨組織剪成1~3 mm大小的組織碎塊,注意使標本保持濕潤狀態(tài)。

    1.2.2軟骨細胞的培養(yǎng) 無菌條件下取得標本后立即置入盛有PBS的無菌培養(yǎng)皿中,無菌生物柜中取材術(shù)中切除的關(guān)節(jié)全層軟骨片(去除周圍軟組織),無菌手術(shù)刀片切塊,剪碎,加入PBS液沖洗,將軟骨移入離心管中,加入Ⅱ型膠原酶,37℃培養(yǎng)箱中消化,其中2 h后每隔20 min晃動離心管一次,至懸液變混濁確定為軟骨塊基本被消化。之后離心,棄上清液。加入完全培養(yǎng)基,充分吹打混勻后可獲得含有軟骨細胞的懸液。倒置顯微鏡觀察軟骨細胞培養(yǎng)各個時期的細胞形態(tài),大小,分布。

    1.2.3MTT比色法測細胞增殖 取對數(shù)生長期的兩種軟骨細胞,接種于96孔板,分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后,加入20 μl MTT孵育4 h后,再加入100 μl DMSO溶解形成的甲瓚晶體,振搖10 min,用酶標儀測定570 nm處的吸光度。

    1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 采用PI/Annexin V法,參照BD公司凋亡檢測試劑盒的說明書操作,將待檢測的兩種軟骨細胞在染色液中(10 ml PI, 1 ml Annexin V-FITC, 10 ml上樣緩沖液和79 ml H2O)室溫孵育15 min后,應(yīng)用用流式細胞儀在488 nm波長氬離子激光下以Elite軟件分析細胞凋亡率。

    1.3線粒體DNA特征與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達

    1.3.1PCR引物及TaqMan探針 本實驗中所有引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成、標記。應(yīng)用熒光檢測物質(zhì)有報告基因FAM 和熄滅基因TAMRA。mtDNA D-loop HV1(Hipervariable region 1, HV1)上游引物5′-TTGCACGGTACCATAAATACTTGAC-3′,下游引物5′-GAGTTGCAGTTGATGTGTGATAGTTG-3′,TaqMan探針5′-CTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAAT-3′,片段長度128 bp。核β-globin基因上游引物5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3′,下游引物 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′,TaqMan探針5′-CTCCTGAG GAGA AGTCTGCT-3′,片段長度110 bp。TFAM上游引物5′-GGAATGTGGAGCGTGCTAAAA-3′,下游引物5′-TGCTGGAAAAACACTTCGGAATA-3′,片段長度118 bp。β-actin上游引物5′-TTCGAGCAAGAGATGGCCA-3′,下游引物 5′-TACATGGTGGTGCCGCC-3′,片段長度270 bp。

    1.3.2細胞線粒體DNA的提取 加RNase(200 μg/ml)于37℃、2~4 h消化RNA。之后,用酚、酚氯仿、異戊醇(體積比為25∶24∶1) DNA以去除蛋白質(zhì)、脂類等其他物質(zhì)。純化后的線粒體DNA量較少,線粒體DNA溶液加入0.6倍體積異丙醇或沉淀緩沖液,置于-20℃下放置30 min,進行離心即得純凈的線粒體DNA。

    1.3.3線粒體DNA拷貝數(shù)的實時熒光定量PCR檢測 以線粒體DNA HV1和核單拷貝基因β-globin分別作為線粒體和核DNA拷貝數(shù)的標記。設(shè)計HV1和β-globin基因的引物及探針,對該基因片段進行PCR擴增,在繪制標準曲線的基礎(chǔ)之上,分別對待測樣本線粒體HV1和β-globin基因進行實時熒光定量PCR檢測。線粒體DNA的拷貝數(shù)計算公式:相對拷貝數(shù)/二倍體核基因組=2×HV1/β-globin。

    1.3.4線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達的測定 RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄cDNA:按照RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA。置于紫外分光光度計上波長為260 nm和280 nm處測量吸光值,計算兩者的比值,選取比值在1.7~2.0者用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA合成嚴格按試劑盒說明書進行,合成的cDNA儲存在-20℃用于PCR反應(yīng)。定量PCR反應(yīng):加入上下游引物各,在7500 Real Time PCR儀監(jiān)測TFAM的表達差異。產(chǎn)物鑒定:取RT-PCR產(chǎn)物加入buffer,經(jīng)電泳后,溴乙錠染色。

    1.4統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS16.0軟件行方差分析及χ2檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1倒置顯微鏡觀察 分離原代軟骨細胞呈球形,大小均一。正常組原代軟骨細胞呈圓形或橢圓形,貼壁較快,6 d后長滿瓶壁,傳代后增殖加快,隨著傳代次數(shù)增加,細胞由橢圓形變?yōu)樗笮渭毎6鳲A組原代細胞貼壁晚,單層集落樣,細胞形態(tài)多不規(guī)則,傳代后細胞以梭形為主,貼壁緩慢,4 d左右長滿瓶壁。

    2.2MTT試驗 正常組增殖在24、48、72、96、120 h均較OA組明顯旺盛(P<0.01),而OA細胞組增殖較慢,到72 h后趨向平臺期。見表1。

    表1 實驗各組MTT試驗結(jié)果圖±s)

    2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 OA組的凋亡率高于正常細胞組(P<0.01),正常細胞凋亡率為1.65%,OA細胞凋亡率為7.11 %。2 μg/L IL-1β作用72 h后,正常細胞凋亡率為13.79%,OA細胞凋亡率為35.13 %。2 μg/L濃度的IL-1β對OA軟骨細胞的凋亡誘導(dǎo)強于正常組(P<0.01)。

    2.4線粒體DNA拷貝數(shù)和TFMA mRNA表達量的變化 HV1和β-globin基因定量PCR標準曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0. 996和0. 998,斜率分別為-3.148和-3.369。OA組線粒體DNA的平均拷貝數(shù)為(389±117),而正常細胞為(756±185),前者顯著低于后者(P<0.01)。

    2.5TFMA mRNA表達量的變化及與線粒體DNA拷貝數(shù)的關(guān)系 定量RT-PCR結(jié)果顯示,OA組TFMA mRNA的表達量(TFMA/β-actin)為0.556±0.021,而正常細胞表達量為1.053±0.024,前者低于后者(P<0.05)。見圖1。表達量和線粒體DNA拷貝數(shù)之間有相關(guān)性(r=0.924,P<0.01);在OA組中,線粒體DNA拷貝數(shù)和TFMA mRNA的表達水平也有相關(guān)性(r=0.906,P<0.05)。

    圖1 各組TFMA mRNA表達

    3 討 論

    軟骨細胞、蛋白多糖和Ⅱ型膠原相互作用,共同維持軟骨的生理性狀,其中任何改變都可以引起軟骨的退變〔4〕。大量研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞凋亡的增加是OA病理改變的重要特征〔5〕,Johnson等〔6〕研究證實,無論是活體還是體外培養(yǎng),OA軟骨中存在過度的軟骨細胞凋亡。Leong等〔7〕認為相比正常的軟骨細胞,OA的軟骨細胞所分泌的蛋白質(zhì)發(fā)生改變,同時合成代謝活動減少、炎性細胞因子的增加和基質(zhì)降解酶活躍,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷。Musumeci等〔8〕研究發(fā)現(xiàn),OA患者不僅軟骨細胞的結(jié)構(gòu)改變,較正常軟骨細胞凋亡的增加,而且基質(zhì)鈣化和蛋白多糖減少。因此,在本研究選擇軟骨細胞作為研究OA的作用點,體外培養(yǎng)觀察表明原代正常組細胞附壁生長和增殖活性良好,具有較好的軟骨細胞生物學(xué)特性,而OA組軟骨細胞的貼壁和增殖較慢,傳代久后生物學(xué)特性基本消失,凋亡明顯增多,對相同濃度IL-1β的誘導(dǎo)反應(yīng)敏感,提示分離的原代OA軟骨細胞符合軟骨細胞退變,為其研究提供了較好的實驗對象。

    Musumeci等〔9〕的研究認為,線粒體的功能障礙是破壞了軟骨細胞在關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境,從而導(dǎo)致了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生〔10〕。OA的軟骨細胞線粒體功能障礙可能來自體細胞中的線粒體DNA突變或炎癥介質(zhì)的直接影響,使軟骨基質(zhì)鈣化和軟骨細胞凋亡的增加。線粒體的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程需要核編碼的一些轉(zhuǎn)錄因子進行調(diào)控,在哺乳動物中起主要調(diào)節(jié)作用的因子是TFAM〔11〕。TFAM是由596 bp核苷酸編碼的25 kD蛋白,具有兩個短串聯(lián)的高親和力的高遷移率族蛋白(HMG)盒域,在結(jié)構(gòu)上包含一個N端頭結(jié)構(gòu)域、兩個HMG box結(jié)構(gòu)域和一個C末端尾結(jié)構(gòu), 兩個HMG box之間還存在一個由27個氨基酸殘基組成的短連接區(qū)域。Rebelo等〔12〕的研究認為,TFAM與線粒體DNA在線粒體中結(jié)合成復(fù)合體,從而保持線粒體DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),OA軟骨細胞TFMA mRNA的表達量低于正常軟骨細胞,說明OA軟骨細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)下降,調(diào)控其轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的主要調(diào)節(jié)因子TFMA的表達也相應(yīng)下調(diào)。Nakanishi等〔13〕研究后認為TFAM可以改善線粒體DNA的損傷和減少,由此產(chǎn)生的氧化還原調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng);Woo等〔14〕研究了敲除線粒體TFAM基因的小鼠,發(fā)現(xiàn)其線粒體DNA出現(xiàn)缺失,同時出現(xiàn)線粒體的氧化損傷。

    在軟骨細胞中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A在線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、結(jié)構(gòu)的維持和損傷修復(fù)及細胞凋亡中均起著重要作用。線粒體DNA自身遺傳結(jié)構(gòu)改變和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A等因素共同作用是導(dǎo)致OA軟骨細胞線粒體DNA拷貝數(shù)改變的原因。

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