黃 彥 梁月屏 廖壯文 呂浩然 謝楚海
(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科,廣東 廣州 510260)
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病〔1〕。關(guān)節(jié)軟骨細胞的過度凋亡是OA發(fā)病的重要病理機制,而軟骨細胞的凋亡與線粒體關(guān)系密切,線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)是線粒體轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的關(guān)鍵激活子,與細胞凋亡過程相逆〔2〕。本研究分析膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者、正常關(guān)節(jié)軟骨細胞的線粒體DNA特征和TFAM表達的差異情況,以期闡明TFAM與OA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。
1.1病例資料 選擇我院2011年10月至2012年10月的膝關(guān)節(jié)OA患者20例,入選OA組,同時設(shè)立因關(guān)節(jié)矯形等手術(shù)剩余的正常關(guān)節(jié)軟骨組織細胞20例。診斷標準:參照中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會制定的OA診治指南(2007年版)的診斷標準〔3〕。納入標準:①女性患者,絕經(jīng)1 年以上, 年齡55~65歲; ②符合上述的診斷標準; ③能夠收集到較為齊全的相關(guān)資料者并簽署知情同意書;④研究前患者均簽訂知情同意書。排除標準:①繼發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎患者;②6個月內(nèi)服用過影響骨代謝藥物的患者;③合并嚴重心、肝、腎以及其他系統(tǒng)疾病者,精神病及腫瘤患者;④不同意和配合進行研究的患者。
1.2收集樣本和建立軟骨細胞的體外培養(yǎng)體系
1.2.1關(guān)節(jié)軟骨的收集 取膝OA關(guān)節(jié)置換手術(shù)中取下關(guān)節(jié)軟骨。取下的軟骨組織置于含青霉素鈉/鏈霉素雙抗PBS液的無菌培養(yǎng)皿中,漂洗去除血細胞和關(guān)節(jié)滑液,清除滑膜組織。最后在含雙抗液的PBS液的無菌培養(yǎng)皿中用眼科剪將軟骨組織剪成1~3 mm大小的組織碎塊,注意使標本保持濕潤狀態(tài)。
1.2.2軟骨細胞的培養(yǎng) 無菌條件下取得標本后立即置入盛有PBS的無菌培養(yǎng)皿中,無菌生物柜中取材術(shù)中切除的關(guān)節(jié)全層軟骨片(去除周圍軟組織),無菌手術(shù)刀片切塊,剪碎,加入PBS液沖洗,將軟骨移入離心管中,加入Ⅱ型膠原酶,37℃培養(yǎng)箱中消化,其中2 h后每隔20 min晃動離心管一次,至懸液變混濁確定為軟骨塊基本被消化。之后離心,棄上清液。加入完全培養(yǎng)基,充分吹打混勻后可獲得含有軟骨細胞的懸液。倒置顯微鏡觀察軟骨細胞培養(yǎng)各個時期的細胞形態(tài),大小,分布。
1.2.3MTT比色法測細胞增殖 取對數(shù)生長期的兩種軟骨細胞,接種于96孔板,分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后,加入20 μl MTT孵育4 h后,再加入100 μl DMSO溶解形成的甲瓚晶體,振搖10 min,用酶標儀測定570 nm處的吸光度。
1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 采用PI/Annexin V法,參照BD公司凋亡檢測試劑盒的說明書操作,將待檢測的兩種軟骨細胞在染色液中(10 ml PI, 1 ml Annexin V-FITC, 10 ml上樣緩沖液和79 ml H2O)室溫孵育15 min后,應(yīng)用用流式細胞儀在488 nm波長氬離子激光下以Elite軟件分析細胞凋亡率。
1.3線粒體DNA特征與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達
1.3.1PCR引物及TaqMan探針 本實驗中所有引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成、標記。應(yīng)用熒光檢測物質(zhì)有報告基因FAM 和熄滅基因TAMRA。mtDNA D-loop HV1(Hipervariable region 1, HV1)上游引物5′-TTGCACGGTACCATAAATACTTGAC-3′,下游引物5′-GAGTTGCAGTTGATGTGTGATAGTTG-3′,TaqMan探針5′-CTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAAT-3′,片段長度128 bp。核β-globin基因上游引物5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3′,下游引物 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′,TaqMan探針5′-CTCCTGAG GAGA AGTCTGCT-3′,片段長度110 bp。TFAM上游引物5′-GGAATGTGGAGCGTGCTAAAA-3′,下游引物5′-TGCTGGAAAAACACTTCGGAATA-3′,片段長度118 bp。β-actin上游引物5′-TTCGAGCAAGAGATGGCCA-3′,下游引物 5′-TACATGGTGGTGCCGCC-3′,片段長度270 bp。
1.3.2細胞線粒體DNA的提取 加RNase(200 μg/ml)于37℃、2~4 h消化RNA。之后,用酚、酚氯仿、異戊醇(體積比為25∶24∶1) DNA以去除蛋白質(zhì)、脂類等其他物質(zhì)。純化后的線粒體DNA量較少,線粒體DNA溶液加入0.6倍體積異丙醇或沉淀緩沖液,置于-20℃下放置30 min,進行離心即得純凈的線粒體DNA。
1.3.3線粒體DNA拷貝數(shù)的實時熒光定量PCR檢測 以線粒體DNA HV1和核單拷貝基因β-globin分別作為線粒體和核DNA拷貝數(shù)的標記。設(shè)計HV1和β-globin基因的引物及探針,對該基因片段進行PCR擴增,在繪制標準曲線的基礎(chǔ)之上,分別對待測樣本線粒體HV1和β-globin基因進行實時熒光定量PCR檢測。線粒體DNA的拷貝數(shù)計算公式:相對拷貝數(shù)/二倍體核基因組=2×HV1/β-globin。
1.3.4線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達的測定 RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄cDNA:按照RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA。置于紫外分光光度計上波長為260 nm和280 nm處測量吸光值,計算兩者的比值,選取比值在1.7~2.0者用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA合成嚴格按試劑盒說明書進行,合成的cDNA儲存在-20℃用于PCR反應(yīng)。定量PCR反應(yīng):加入上下游引物各,在7500 Real Time PCR儀監(jiān)測TFAM的表達差異。產(chǎn)物鑒定:取RT-PCR產(chǎn)物加入buffer,經(jīng)電泳后,溴乙錠染色。
1.4統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS16.0軟件行方差分析及χ2檢驗。
2.1倒置顯微鏡觀察 分離原代軟骨細胞呈球形,大小均一。正常組原代軟骨細胞呈圓形或橢圓形,貼壁較快,6 d后長滿瓶壁,傳代后增殖加快,隨著傳代次數(shù)增加,細胞由橢圓形變?yōu)樗笮渭毎6鳲A組原代細胞貼壁晚,單層集落樣,細胞形態(tài)多不規(guī)則,傳代后細胞以梭形為主,貼壁緩慢,4 d左右長滿瓶壁。
2.2MTT試驗 正常組增殖在24、48、72、96、120 h均較OA組明顯旺盛(P<0.01),而OA細胞組增殖較慢,到72 h后趨向平臺期。見表1。
表1 實驗各組MTT試驗結(jié)果圖±s)
2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 OA組的凋亡率高于正常細胞組(P<0.01),正常細胞凋亡率為1.65%,OA細胞凋亡率為7.11 %。2 μg/L IL-1β作用72 h后,正常細胞凋亡率為13.79%,OA細胞凋亡率為35.13 %。2 μg/L濃度的IL-1β對OA軟骨細胞的凋亡誘導(dǎo)強于正常組(P<0.01)。
2.4線粒體DNA拷貝數(shù)和TFMA mRNA表達量的變化 HV1和β-globin基因定量PCR標準曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0. 996和0. 998,斜率分別為-3.148和-3.369。OA組線粒體DNA的平均拷貝數(shù)為(389±117),而正常細胞為(756±185),前者顯著低于后者(P<0.01)。
2.5TFMA mRNA表達量的變化及與線粒體DNA拷貝數(shù)的關(guān)系 定量RT-PCR結(jié)果顯示,OA組TFMA mRNA的表達量(TFMA/β-actin)為0.556±0.021,而正常細胞表達量為1.053±0.024,前者低于后者(P<0.05)。見圖1。表達量和線粒體DNA拷貝數(shù)之間有相關(guān)性(r=0.924,P<0.01);在OA組中,線粒體DNA拷貝數(shù)和TFMA mRNA的表達水平也有相關(guān)性(r=0.906,P<0.05)。
圖1 各組TFMA mRNA表達
軟骨細胞、蛋白多糖和Ⅱ型膠原相互作用,共同維持軟骨的生理性狀,其中任何改變都可以引起軟骨的退變〔4〕。大量研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞凋亡的增加是OA病理改變的重要特征〔5〕,Johnson等〔6〕研究證實,無論是活體還是體外培養(yǎng),OA軟骨中存在過度的軟骨細胞凋亡。Leong等〔7〕認為相比正常的軟骨細胞,OA的軟骨細胞所分泌的蛋白質(zhì)發(fā)生改變,同時合成代謝活動減少、炎性細胞因子的增加和基質(zhì)降解酶活躍,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷。Musumeci等〔8〕研究發(fā)現(xiàn),OA患者不僅軟骨細胞的結(jié)構(gòu)改變,較正常軟骨細胞凋亡的增加,而且基質(zhì)鈣化和蛋白多糖減少。因此,在本研究選擇軟骨細胞作為研究OA的作用點,體外培養(yǎng)觀察表明原代正常組細胞附壁生長和增殖活性良好,具有較好的軟骨細胞生物學(xué)特性,而OA組軟骨細胞的貼壁和增殖較慢,傳代久后生物學(xué)特性基本消失,凋亡明顯增多,對相同濃度IL-1β的誘導(dǎo)反應(yīng)敏感,提示分離的原代OA軟骨細胞符合軟骨細胞退變,為其研究提供了較好的實驗對象。
Musumeci等〔9〕的研究認為,線粒體的功能障礙是破壞了軟骨細胞在關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境,從而導(dǎo)致了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生〔10〕。OA的軟骨細胞線粒體功能障礙可能來自體細胞中的線粒體DNA突變或炎癥介質(zhì)的直接影響,使軟骨基質(zhì)鈣化和軟骨細胞凋亡的增加。線粒體的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程需要核編碼的一些轉(zhuǎn)錄因子進行調(diào)控,在哺乳動物中起主要調(diào)節(jié)作用的因子是TFAM〔11〕。TFAM是由596 bp核苷酸編碼的25 kD蛋白,具有兩個短串聯(lián)的高親和力的高遷移率族蛋白(HMG)盒域,在結(jié)構(gòu)上包含一個N端頭結(jié)構(gòu)域、兩個HMG box結(jié)構(gòu)域和一個C末端尾結(jié)構(gòu), 兩個HMG box之間還存在一個由27個氨基酸殘基組成的短連接區(qū)域。Rebelo等〔12〕的研究認為,TFAM與線粒體DNA在線粒體中結(jié)合成復(fù)合體,從而保持線粒體DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),OA軟骨細胞TFMA mRNA的表達量低于正常軟骨細胞,說明OA軟骨細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)下降,調(diào)控其轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的主要調(diào)節(jié)因子TFMA的表達也相應(yīng)下調(diào)。Nakanishi等〔13〕研究后認為TFAM可以改善線粒體DNA的損傷和減少,由此產(chǎn)生的氧化還原調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng);Woo等〔14〕研究了敲除線粒體TFAM基因的小鼠,發(fā)現(xiàn)其線粒體DNA出現(xiàn)缺失,同時出現(xiàn)線粒體的氧化損傷。
在軟骨細胞中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A在線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、結(jié)構(gòu)的維持和損傷修復(fù)及細胞凋亡中均起著重要作用。線粒體DNA自身遺傳結(jié)構(gòu)改變和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A等因素共同作用是導(dǎo)致OA軟骨細胞線粒體DNA拷貝數(shù)改變的原因。
4 參考文獻
1Sinusas K. Osteoarthritis: diagnosis and treatment〔J〕. Am Fam Phys,2012; 85(1):49-56.
2Iliopoulos D, Gkretsi V, Tsezou A. Proteomics of osteoarthritic chondrocytes and cartilage〔J〕. Expert Rev Proteomics, 2010;7(5):749-60.
3中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會. 骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)〔J〕.中國臨床醫(yī)生,2008; 1: 28-30.
4Danisovic L, Varga I, Zamborsky R,etal. The tissue engineering of articular cartilage: cells, scaffolds and stimulating factors〔J〕. Exp Biol Med (Maywood), 2012; 237(1):10-7.
5Zamli Z, Sharif M. Chondrocyte apoptosis: a cause or consequence of osteoarthritis〔J〕?Int J Rheum Dis, 2011;14(2):159-66.
6Johnson EO, Charchandi A, Babis GC,etal. Apoptosis in osteoarthritis: morphology, mechanisms, and potential means for therapeutic intervention〔J〕. J Surg Orthop Adv, 2008;17(3):147-52.
7Leong DJ, Sun HB. Events in articular chondrocytes with aging〔J〕. Curr Osteoporos Rep, 2011; 9(4):196-201.
8Musumeci G, Loreto C, Carnazza ML,etal. Characterization of apoptosis in articular cartilage derived from the knee joints of patients with osteoarthritis〔J〕. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2011; 19(2):307-13.
9Musumeci G, Loreto C, Carnazza ML,etal. OA cartilage derived chondrocytes encapsulated in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) for the evaluation of cartilage restoration and apoptosis in an in vitro model〔J〕. Histol Histopathol, 2011; 26(10):1265-78.
10Blanco FJ, Rego I, Ruiz-Romero C. The role of mitochondria in osteoarthritis〔J〕. Nat Rev Rheumatol, 2011;7(3):161-9.
11Canugovi C, Maynard S, Bayne AC, The mitochondrial transcription factor A functions in mitochondrial base excision repair〔J〕. DNA Repair (Amst), 2010; 9(10):1080-9.
12Rebelo AP, Williams SL, Moraes CT. In vivo methylation of mtDNA reveals the dynamics of protein-mtDNA interactions〔J〕. Nucleic Acids Res, 2009;37(20):6701-15.
13Nakanishi H, Hayashi Y, Wu Z. The role of microglial mtDNA damage in age-dependent prolonged LPS-induced sickness behavior〔J〕. Neuron Glia Biol, 2011;28(1):1-7.
14Woo DK, Green PD, Santos JH,etal. Mitochondrial genome instability and ROS enhance intestinal tumorigenesis in APC(Min/+) mice〔J〕. Am J Pathol, 2012;180(1):24-31.