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    胰島素巰基化透明質(zhì)酸納米粒的制備與體外性質(zhì)評(píng)價(jià)

    2014-09-13 07:14:54黃愛(ài)文趙佳麗劉志宏曾棋平宋洪濤
    中國(guó)生化藥物雜志 2014年7期
    關(guān)鍵詞:保護(hù)劑巰基凍干

    黃愛(ài)文,趙佳麗,2,劉志宏,曾棋平,3,宋洪濤,2,3Δ

    (1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科,福建福州350025;2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院,福建廈門361005;3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,福建福州350108)

    胰島素巰基化透明質(zhì)酸納米粒的制備與體外性質(zhì)評(píng)價(jià)

    黃愛(ài)文1,趙佳麗1,2,劉志宏1,曾棋平1,3,宋洪濤1,2,3Δ

    (1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科,福建福州350025;2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院,福建廈門361005;3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,福建福州350108)

    目的制備胰島素巰基化透明質(zhì)酸納米粒(insulin thiolated hyaluronic acid nanoparticles,Ins-HA-Cys-NPs),考察納米粒的理化性質(zhì)。方法以合成的具有生物黏附性質(zhì)的巰基化透明質(zhì)酸作為載體,采用超聲乳化法制備納米粒,考察其外觀、粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量,并進(jìn)行其凍干制劑的凍干保護(hù)劑篩選。結(jié)果制備的Ins-HA-Cys-NPs粒徑均一,外觀圓整;平均粒徑為(178.5± 0.8)nm,PDI為(0.214±0.013),Zeta電位為-(38.47±0.46)mV,超濾離心法測(cè)定載藥納米粒的包封率為(48.85±0.66)%,載藥量為(4.79±0.13)%;選擇10%的甘露醇為凍干保護(hù)劑,復(fù)溶后得到具有藍(lán)色乳光的粒徑均一的納米?;鞈乙?。結(jié)論巰基化透明質(zhì)酸納米粒是蛋白多肽類藥物口服給藥的潛在載體,為下一步研究胰島素納米粒在大鼠體內(nèi)藥效、藥動(dòng)學(xué)研究提供前提和基礎(chǔ)。

    巰基化透明質(zhì)酸;胰島素;納米粒

    胰島素(insulin,Ins)為目前臨床上治療糖尿病的一線藥物。臨床用胰島素制劑皆為注射劑??诜o藥方式可提高患者順應(yīng)性,減輕糖尿病患者的痛苦,因而研究胰島素口服制劑一直是藥劑學(xué)的熱點(diǎn)之一[1]。但是胰島素由于自身穩(wěn)定性差,口服易被胃腸道酶水解,且對(duì)腸道黏膜通透性低,口服生物利用度一直較低[2]。

    納米給藥系統(tǒng)能夠提高蛋白、多肽類藥物在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性,保護(hù)包載的藥物,并且有利于黏膜對(duì)藥物的攝取以及轉(zhuǎn)運(yùn),因此成為解決多肽、蛋白質(zhì)類藥物口服吸收難題的一個(gè)較為有效的方法[3]。透明質(zhì)酸(HA)是一種存在于高等動(dòng)物機(jī)體內(nèi)多種組織、器官中的天然大分子多聚糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性以及生物黏附性能,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及藥物傳遞系統(tǒng)方面均有較多的應(yīng)用[4-5]。將透明質(zhì)酸與L-半胱氨酸(Cys)鹽酸鹽通過(guò)酰胺鍵連接得到新型的生物黏附性聚合物——巰基化透明質(zhì)酸(HA-Cys)。本研究將生物黏附性技術(shù)與納米載體相結(jié)合,以巰基化透明質(zhì)酸為生物黏附性材料制備包載胰島素的納米粒,并對(duì)其體外性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器 透明質(zhì)酸鈉(500 kDa,鎮(zhèn)江東元生物科技有限公司);胰島素(27.8 U/mg,徐州萬(wàn)邦金橋制藥有限公司);吐溫80(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑);油酸聚乙二醇甘油酯(法國(guó)GATTEFOSSE公司);1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)(阿拉丁試劑);豬胃黏膜蛋白(美國(guó)Sigma公司)。

    Model 680型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司);AVANCE III 500核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);Nicolet Avatar 330型傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)熱電公司);JY88-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);RE2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);NicompTM-380型粒度電位測(cè)定儀(美國(guó)PSS公司);CHRIST ALPHA 1-2型冷凍干燥機(jī)(瑞士CHRIST ALPHA公司);JEM-1400型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社);Agilent1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 HA-Cys的制備:HA-Cys的制備,參照文獻(xiàn)[6]的方法,稱取HA(MW500kDa),加蒸餾水溶解制成0.4%溶液,分別加入終濃度為50mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS),加1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.50,室溫下避光攪拌反應(yīng)45min;稱取L-半胱氨酸鹽酸鹽(其與透明質(zhì)酸質(zhì)量比為1:2)加至反應(yīng)體系中,加1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.75,室溫下避光攪拌反應(yīng)5 h;依次以5mmol/mL HCl溶液、含1%(w/v)NaCl的5 mmol/mL HCl溶液和1mmol/mL HCl溶液作為透析液,4℃避光透析3 d,冷凍干燥24 h,制得HA-Cys聚合物,結(jié)構(gòu)驗(yàn)證經(jīng)1H-NMR以及紅外光譜分析,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 HA-Cys的巰基含量測(cè)定:濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.3μmol/mL的Cys溶液500μL與500μL Ellman's試劑(以0.5mol/L pH8.0 PBS配制的0.3mg/mL DTNB溶液),進(jìn)行顯色反應(yīng),多功能酶標(biāo)儀測(cè)量反應(yīng)生成物在450 nm處的吸光度,建立吸光度-巰基濃度擬合方程。

    精密稱取10mg HA-Cys,加入2.5mL三蒸水溶解,取250μL溶液,加入250μL 0.5 mol/L pH8.0 PBS和500μL Ellman's試劑,室溫、避光反應(yīng)2 h,測(cè)定450 nm處的吸光度。根據(jù)擬合方程計(jì)算巰基(-SH)含量,結(jié)果以每1 g HA-Cys含巰基的量(μmol)表示(μmol/g)。

    1.2.3 HA-Cys材料自身的體外黏附性質(zhì)評(píng)價(jià):以黏蛋白微粒結(jié)合法評(píng)價(jià)HA-Cys的體外黏附性質(zhì)[7]。取豬胃黏膜蛋白粉末溶于磷酸鹽緩沖液(PBS,pH6.8)中,配成濃度為1%的混懸液,攪拌過(guò)夜使之充分混懸。將黏蛋白混懸液在冰水浴中探頭超聲10min后(功率200W),以6000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15min,取上清液稀釋到濃度為0.5%,可得到亞微米級(jí)黏蛋白混懸液(ss-mucin particle suspension)。將不同濃度0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的HA-Cys的PBS溶液2mL(pH6.8)加入上述黏蛋白混懸液2mL中,于37℃下孵育2 h后,測(cè)定其電位的變化。

    1.2.4 Ins-HA-Cys-NPs的制備:稱取HA-Cys 26mg加三蒸水溶解,加入以0.005mol/L NaOH溶液溶解的8mg胰島素,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的吐溫80,混合均勻作為水相,與油相正己烷(含1.0%油酸聚乙二醇甘油酯)以體積比1:4混合,探頭超聲2min(功率400W)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h除去有機(jī)溶劑,加蒸餾水至20mL,再次探頭超聲,獲得納米?;鞈乙?。

    1.2.5 Ins-HA-Cys-NPs理化性質(zhì)評(píng)價(jià)

    ①納米粒粒徑及Zeta電位的測(cè)定

    以NicompTM-380ZLS型粒度電位測(cè)定儀測(cè)定Ins-HA-Cys-NPs的Zeta電位、粒徑及分布,將樣品稀釋至合適濃度進(jìn)行測(cè)定。

    ②包封率和載藥量的測(cè)定

    采用超濾離心法[8]測(cè)定,其中超濾膜截留的相對(duì)分子質(zhì)量為100 kDa,精密加入胰島素納米?;鞈乙?00μL、10℃、6 000 r/min離心30min。取濾液進(jìn)高效液相色譜儀,測(cè)定游離胰島素的含量,按下式計(jì)算納米粒的包封率及載藥量:

    包封率(EE%)=(胰島素的總質(zhì)量-游離胰島素的質(zhì)量)/胰島素的總質(zhì)量×100%

    載藥量(DL%)=(胰島素的總質(zhì)量-游離胰島素的質(zhì)量)/納米制劑的總質(zhì)量×100%

    ③納米粒形態(tài)觀察

    采用透射電鏡觀察制備的Ins-HA-Cys-NPs的形態(tài)。取適量納米粒溶液,稀釋到一定濃度后,滴至覆有碳膜的銅網(wǎng)上,停留2~3min,以濾紙吸去多余溶液,滴加2%磷鎢酸溶液負(fù)染2min,紅外燈下干燥,透射電鏡觀察,拍照。

    1.2.6 凍干保護(hù)劑的選擇:胰島素納米粒混懸液制備成凍干制劑進(jìn)行保存,將常用凍干保護(hù)劑葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘露醇[9]以一定的量加入納米?;鞈乙褐?,裝于西林瓶中,攪拌使之溶解。該溶液于-80℃預(yù)凍8 h,冷凍干燥48 h。凍干樣品加水4mL復(fù)溶,以外觀、再分散性、粒徑、包封率、載藥量、Zeta電位等作為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選最佳凍干保護(hù)劑。

    評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):制得的凍干制劑外觀以維持原體積,不塌陷,不皺縮,質(zhì)地細(xì)膩,表面光潔,可整塊脫落但不粉碎為佳,加蒸餾水復(fù)溶并輕微振搖后,即分散成均勻有藍(lán)色乳光的膠體溶液,表明再分散性良好,再分散時(shí)間以30 s以內(nèi)為佳。各指標(biāo)以10分制進(jìn)行評(píng)分(見(jiàn)表1)。

    表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Scoring standard

    2 結(jié)果

    2.1 HA-Cys的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

    2.1.11H-NMR分析:圖1為HA和HA-Cys的1H-NMR圖譜,在3.3~3.9 ppm之間的多重峰對(duì)應(yīng)的是透明質(zhì)酸分子中的糖環(huán)結(jié)構(gòu)。HA-Cys圖譜(圖1B)中2.88 ppm處的信號(hào)峰歸屬于Cys分子亞甲基上的氫原子,這表明Cys已共價(jià)連接至HA上。

    圖1 HA(A)和HA-Cys(B)的核磁共振氫譜Fig.1 1 H-NMR spectrum of HA(A)and HA-Cys(B)

    2.1.2 紅外光譜分析:HA,HA-Cys的紅外譜圖見(jiàn)圖3。與未修飾的HA相比,在2500 cm-1附近出現(xiàn)的新波段確證了HACys的形成是由于巰基基團(tuán)的吸收造成的。

    圖2 HA(A)和HA-Cys(B)紅外掃描圖譜Fig.2 IR spectrum of HA(A)and HA-Cys(B)

    2.2 HA-Cys的巰基含量測(cè)定 經(jīng)冷凍干燥獲得的HA-Cys聚合物為白色纖維狀物質(zhì)。按照1.2.2項(xiàng)下方法得到的擬合方程為A=3.157C-0.012(r=0.9996),將測(cè)得的HA-Cys與DTNB反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值,代入上述擬合方程,得到游離巰基含量為(225.7±4.4)μmol/g。

    2.3 HA-Cys材料自身的體外黏附性質(zhì)評(píng)價(jià) 黏蛋白屬于一類大分子糖蛋白,其黏蛋白結(jié)構(gòu)中存在的唾液酸殘基以及硫酸化糖分子使黏蛋白等電點(diǎn)降低,在胃腸道生理pH環(huán)境下,黏蛋白荷負(fù)電[10]。黏蛋白混懸液與不同濃度的HA-Cys溶液孵育后的Zeta電位變化如圖4所示。結(jié)果表明:在與HA-Cys溶液共同孵育2 h后,黏蛋白納米粒的Zeta電位由-18.4 mV變得更低,且其Zeta電位隨著HA-Cys溶液濃度的增加而逐漸降低,這說(shuō)明在pH=6.8的PBS環(huán)境中HA-Cys對(duì)黏蛋白納米粒具有良好的黏附性,可穩(wěn)定地吸附在黏蛋白納米粒表面從而改變其表面電荷。

    圖3 不同濃度HA-Cys結(jié)合黏蛋白微粒的Zeta電位改變Fig.3 Zeta potential of ss-mucin particles in the solution of HA-Cys with various concentration

    2.4 Ins-HA-Cys-NPs理化性質(zhì)評(píng)價(jià) 制備的納米粒混懸液外觀呈淡藍(lán)色乳光。測(cè)定納米粒粒徑以及電位,平均粒徑為(178.5±0.8)nm,多分散系數(shù)為(0.214±0.01),Zeta電位為-(38.47±0.46)mV;超濾離心法測(cè)定載藥納米粒的包封率為(48.85±0.66)%,載藥量為(4.79±0.13)%。

    2.5 Ins-HA-Cys-NPs形態(tài)觀察 如圖4所示,在透射電鏡掃描下,可見(jiàn)粒子表面光滑圓整,呈類圓球形,且分布均一,其與粒度電位測(cè)定儀所測(cè)定的粒徑大小相近。

    圖4 Ins-HA-Cys-NPs透射電鏡圖Fig.4 TEM photo of Ins-HA-Cys-NPs

    2.6 Ins-HA-Cys-NPs凍干保護(hù)劑的選擇 冷凍干燥是確保聚合物納米顆粒的長(zhǎng)期保存的一項(xiàng)常用技術(shù)。納米粒混懸液長(zhǎng)期儲(chǔ)存易產(chǎn)生增溶,聚合物降解,藥物泄露、解吸附或降解等情況,并且具有聚集成團(tuán)的傾向[11]。因此需要在冷凍干燥前加入合適的凍干保護(hù)劑,防止納米粒的團(tuán)聚,減少藥物泄漏。選擇常用的凍干保護(hù)劑進(jìn)行篩選(見(jiàn)表2)。

    表2 凍干保護(hù)劑篩選結(jié)果Tab.2 Results of the cryoprotectant selection

    由表2可知,不添加凍干保護(hù)劑,凍干后的制劑萎縮成一層透明薄膜,不能保持原液體積;以葡萄糖和乳糖作保護(hù)劑,凍干后體積干縮,不夠整齊飽滿,并易吸潮;而以甘露醇作保護(hù)劑,其凍干制劑的外觀等指標(biāo)均較符合要求,綜合評(píng)分為24分以上,且以10%甘露醇為最佳。選取綜合評(píng)分相對(duì)較高的6、10、11、12、13號(hào)凍干制劑以粒徑、多分散指數(shù)、Zeta電位、包封率以及載藥量進(jìn)行下一步的篩選,結(jié)果如表3所示。

    表3 凍干保護(hù)劑對(duì)凍干后納米粒性質(zhì)的影響Tab.3 Effect of cryoprotectant agents on nanoparticles after freeze drying

    由表3可知,以10%的甘露醇為凍干保護(hù)劑,所測(cè)得的粒徑、多分散指數(shù)、Zeta電位、包封率及載藥量與凍干前樣品測(cè)得的數(shù)據(jù)較相近。因此選擇以10%甘露醇作為凍干保護(hù)劑。采用冷凍干燥工藝制得的HA-Cys-NPs納米粒凍干制劑,呈白色餅狀,色澤均一,表面不塌陷,不皺縮。將該凍干制劑以蒸餾水復(fù)溶稀釋,復(fù)溶速度快,得到具有藍(lán)色乳光、均一的納米粒混懸液。

    3 討論

    以EDAC/NHS為催化體系,將透明質(zhì)酸與L-半胱氨酸通過(guò)酰胺鍵連接,制備巰基化透明質(zhì)酸,測(cè)定其巰基含量為(225.7± 4.4)μmol/g。適當(dāng)范圍內(nèi)較高的巰基含量可在避免巰基自氧化的情況下提高巰基氧化的速率,從而改善黏膜粘附性能。本實(shí)驗(yàn)制備的巰基化透明質(zhì)酸的巰基含量同既往文獻(xiàn)報(bào)道巰基含量為201.3μmol/g[12],210.58μmol/g[13]的結(jié)果相當(dāng),能夠有效改善納米粒的黏膜粘附性能。

    巰基化聚合物使藥物黏附在腸道黏膜表面,減少藥物與腸道蛋白酶接觸,從而減少藥物的降解;并且其作為載體可以提高黏液層藥物濃度,使得吸附-吸收部位產(chǎn)生一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞被動(dòng)吸收的驅(qū)動(dòng)力,增強(qiáng)藥物的口服吸收。采用黏蛋白微粒法評(píng)價(jià)制備的HA-Cys聚合物的體外黏附性,結(jié)果表明HA-Cys在中性介質(zhì)中能較好地與黏蛋白微粒結(jié)合,從而改變其Zeta電位。這說(shuō)明在pH 6.8的PBS環(huán)境中HA-Cys對(duì)黏蛋白微粒具有良好的黏附性,可穩(wěn)定地吸附在黏蛋白納米粒表面從而改變其表面電荷。這種吸附除了歸因巰基化透明質(zhì)酸的范德華力及氫鍵作用外,還與其結(jié)構(gòu)上的游離巰基有關(guān),巰基化透明質(zhì)酸與黏蛋白表面的帶游離巰基的半胱氨酸殘基之間通過(guò)巰基氧化而交聯(lián)形成二硫鍵,從而以共價(jià)鍵的形式增強(qiáng)了2者之間的相互作用,提高其在黏蛋白微粒表面的黏附量。

    制備的Ins-HA-Cys-NPs粒徑為200 nm左右,據(jù)報(bào)道[14-15],粒徑為50~500 nm的納米??赏ㄟ^(guò)腸道內(nèi)Peyer's patch上的M細(xì)胞吞噬,增加藥物的吸收。測(cè)量Zeta電位可以預(yù)測(cè)納米粒組成的分散體系的穩(wěn)定性。通常,納米粒Zeta電位的絕對(duì)值越大,納米粒之間的相互排斥力也越大,體系也就越穩(wěn)定[16]。本研究Ins-HA-Cys-NPs的Zeta電位為-(38.47±0.46)mV,說(shuō)明納米粒體系較穩(wěn)定[16]。采用超濾離心法測(cè)定納米粒的包封率為(48.85±0.66)%、載藥量為(4.79±0.13)%。實(shí)驗(yàn)中,超濾膜將納米粒截留于管中,游離藥物處于下清液中,納米粒子與游離藥物可得到較好的分離,保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    本研究制備的Ins-HA-Cys-NPs粒徑較小,分布均一,選擇10%的甘露醇為凍干保護(hù)劑,復(fù)溶后得到具有藍(lán)色乳光的粒徑均一的納米?;鞈乙海野饴?、載藥量均無(wú)顯著變化。說(shuō)明采用本實(shí)驗(yàn)報(bào)道方法制備納米粒具有較好的可行性,其為體內(nèi)藥效學(xué)的進(jìn)一步研究提供了一定的基礎(chǔ),作為蛋白多肽類藥物的口服遞送載體具有良好的應(yīng)用前景。

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    (編校:王儼儼)

    Preparation and evaluation of insulin thiolated hyaluronic acid nanoparticles in vitro

    HUANG Ai-wen1,ZHAO Jia-li1,2,LIU Zhi-hong1,ZENG Qi-ping1,3,SONG Hong-tao1,2,3Δ

    (1.Department of Pharmacy,F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing Military Region,F(xiàn)uzhou 350025,China;2.College of Medicine,Xiamen University,Xiamen 360005,China;3.College of Pharmacy,F(xiàn)ujian Medical University,F(xiàn)uzhou 350108,China)

    ObjectiveTo prepare insulin thiolated hyaluronic acid nanoparticles(Ins-HA-Cys-NPs)and study its physicochemical properties.MethodsThe Ins-HA-Cys-NPs was prepared by ultrasonic emulsifying method,and the properties of nanoparticles including morphology,mean diameter,Zeta potential,entrapment efficiency and drug loading efficiency were studied,as well as the cryoprotectant selection.ResultsThe prepared nanoparticleswas round in appearance and the mean diameter was(178.5±0.8)nm,the polydispersity index was(0.214±0.013)and the Zeta potentialwas-(38.47±0.46)mV,while the entrapment efficiency was(48.85±0.66)%,drug loading efficiency was(4.79±0.13)%;10% mannitol as cryoprotectant provided uniform and well dispersed suspension of nanoparticles with blue opalescence after redispersion.ConclusionThe thiolated hyaluronic acid nanoparticlesmay be used as the carrier for oral drug delivery system of insulin,and it provides a basis for studies on rats in vivo.

    thiolated hyaluronic acid;insulin;nanoparticles

    R944.9

    A

    1005-1678(2014)07-0077-04

    福建省自然科學(xué)基金(2012J05159)

    黃愛(ài)文,女,主管藥師,研究方向:藥物新劑型與制劑新技術(shù),E-mail:haw83@163.com;宋洪濤,通信作者,男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:藥物新劑型與制劑新技術(shù)、臨床藥學(xué),E-mail:sohoto@vip.163.com。

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