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    iRGD 修飾脂質(zhì)體的制備及其結(jié)腸癌靶向性研究

    2014-09-13 07:14:52鐘玲李思齊楊蔚曾蓉毛琴陳嘉勇
    中國生化藥物雜志 2014年7期
    關(guān)鍵詞:云南昆明整合素脂質(zhì)體

    鐘玲,李思齊,楊蔚,曾蓉,毛琴,陳嘉勇Δ

    (1.昆明醫(yī)科大學(xué),云南昆明650500;2.云南省第一人民醫(yī)院急診科,云南昆明650032;3.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科,云南昆明650101)

    iRGD 修飾脂質(zhì)體的制備及其結(jié)腸癌靶向性研究

    鐘玲1,2,李思齊3,楊蔚2,曾蓉2,毛琴2,陳嘉勇3Δ

    (1.昆明醫(yī)科大學(xué),云南昆明650500;2.云南省第一人民醫(yī)院急診科,云南昆明650032;3.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科,云南昆明650101)

    目的制備iRGD修飾脂質(zhì)體(iRGD-LP),研究其結(jié)腸癌靶向性。方法采用薄膜分散法制備iRGD修飾脂質(zhì)體(iRGD-LP),研究脂質(zhì)體的粒徑和電位;通過定性和定量細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)研究結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對普通脂質(zhì)體(LP)和iRGD修飾脂質(zhì)體(iRGD-LP)的攝取效率。構(gòu)建結(jié)腸癌RKO細(xì)胞腫瘤球模型,研究脂質(zhì)體的腫瘤球穿透能力;構(gòu)建結(jié)腸癌裸鼠異位模型,研究iRGDLP的體內(nèi)分布。結(jié)果iRGD-LP的粒徑為(109.4±12.9)nm,電位為(4.2±1.47)mV;結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對iRGD-LP的攝取效率是LP的3.2倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);細(xì)胞腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示iRGD-LP具有良好的腫瘤細(xì)胞靶向性。結(jié)論iRGD修飾脂質(zhì)體是一種潛在高效的結(jié)腸癌靶向給藥系統(tǒng)。

    結(jié)腸癌;脂質(zhì)體;藥物靶向;iRGD

    在過去幾十年,隨著現(xiàn)代生物研究的發(fā)展,腫瘤疾病的治療手段也日益豐富。根據(jù)腫瘤組織的特點(diǎn)進(jìn)行靶向治療成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[1]。整合素受體(integrins receptors)在黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá),因此整合素αvβ3常被用作腫瘤靶向的特異性靶點(diǎn)[2-5]。iRGD是一條序列為CRGDRGPDC的多肽片段,它既能有效識(shí)別整合素受體又能高效穿過細(xì)胞膜[6]。本研究將iRGD連接到脂質(zhì)體的表面,研究其對結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向性,為進(jìn)一步的體內(nèi)抗腫瘤研究提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器 Leica 7CSSP5雙掃描激光共聚焦顯微鏡(Leica公司);大豆磷脂(SPC)和DSPE-PEG2000(美國Avanti材料公司);iRGD(上海吉爾生化公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);香豆素-6(coumarin-6,美國sigma公司);胎牛血清(美國GIBCO公司);人源結(jié)腸癌細(xì)胞(RKO,上海細(xì)胞研究所);雄性裸鼠20~25g(成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,動(dòng)物合格證號(hào):DSDW2013-022)。

    1.2 方法

    1.2.1 iRGD修飾脂質(zhì)體的制備:參照文獻(xiàn)方法[7-9]合成iRGD-PEG2000-DSPE。精密稱取適量SPC,膽固醇,DSPEPEG2000-OMe,iRGD-PEG2000-DSPE,香豆素-6或DIR,將以上材料溶于氯仿中,減壓蒸發(fā)后加入2 mL PBS水化得到iRGD修飾脂質(zhì)體(iRGD-LP)。取適量樣品用粒度儀測定其粒徑以及電位。

    1.2.2 RKO細(xì)胞對iRGD-LP的攝?。簩KO細(xì)胞以5× 105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,24 h后,加入適量LP和iRGDLP,使孔中脂質(zhì)體濃度為120 nmol/L,37℃分別孵育2 h和4 h后,冷PBS沖洗2次,流式細(xì)胞儀檢測各樣品的熒光強(qiáng)度。將脂質(zhì)體與細(xì)胞共同孵育4 h后,冷PBS沖洗2次,每孔加入4%多聚甲醛固定15min,棄去多聚甲醛,加入2μg/mL DAPI溶液,遮光染色5 min,冷PBS沖洗2次,甘油封片保存。共聚焦顯微鏡觀察。

    1.2.3 iRGD-LP的腫瘤球穿透能力:參照文獻(xiàn)方法[7]培養(yǎng)細(xì)胞腫瘤球,分別加入適量LP和iRGD-LP,使孔中脂質(zhì)體濃度為120 nmol/L。37℃孵育4 h后,冷PBS沖洗2次,甘油封片保存。共聚焦顯微鏡觀察。

    1.2.4 裸鼠異位瘤的構(gòu)建:取體質(zhì)量20~25 g的雄性裸鼠,將RKO細(xì)胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部,7 d后出現(xiàn)米粒大腫瘤證實(shí)接種成功。取建模成功后的裸鼠尾靜脈注射1.2.1項(xiàng)下制備的載DIR脂質(zhì)體0.1mL,24 h后,置于近紅外活體成像下觀察。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示,多組間樣本均數(shù)兩兩比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 iRGD-LP的表征 制備得到的iRGD-LP和LP表征結(jié)果見表1。

    表1 脂質(zhì)體的表征(n=3)Tab.1 Characteristics of liposomes(n=3)

    2.2 RKO細(xì)胞對iRGD-LP的攝取 體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞共孵育8h后,RKO細(xì)胞對iRGD-LP攝取效率是普通脂質(zhì)體的3.2倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。RKO細(xì)胞對iRGD-LP攝取隨著孵育時(shí)間延長而增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。共聚焦結(jié)果顯示:iRGDLP組在細(xì)胞核周圍綠色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于LP組(見圖1)。

    表2 RKO細(xì)胞對不同脂質(zhì)體的攝取效率(n=3)Tab.2 Uptake of different liposomes by RKO cells(n=3)

    圖1 激光共聚焦觀察RKO細(xì)胞對載香豆素-6脂質(zhì)體的攝取.Fig.1 Uptake of coumarin-6 loaded liposome by RKO cells based on confocal laser scanningmicroscopy

    2.3 iRGD-LP對RKO細(xì)胞腫瘤球的穿透作用 腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:iRGD-LP組在腫瘤中綠色熒光明顯強(qiáng)于LP組(見圖2),說明iRGD能夠有效增強(qiáng)脂質(zhì)體對腫瘤球的穿透作用。

    圖2 載香豆素-6脂質(zhì)體對RKO細(xì)胞腫瘤球的穿透實(shí)驗(yàn)Fig.2 Uptake of coumarin-6 loaded liposomes by RKO tumor spheroids based on confocal laser scanningmicroscopy

    2.4 體內(nèi)活體成像 荷瘤裸鼠活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:iRGD修飾脂質(zhì)體組的荷瘤裸鼠腫瘤組織熒光最強(qiáng),明顯強(qiáng)于LP(見圖3)。

    圖3 載DIR的不同類型的脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的分布Fig.3 EX vivo images of given various DIR loaded liposomes

    3 討論

    研究表明,具環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RGD能夠顯示出和整合素αvβ3、αvβ5的高度親和力[10-12]。其與整合素αvβ3的親和力約為線性RGD的1000倍[13-15]。國內(nèi)外許多研究者都利用RGD與整合素αvβ3的特異性結(jié)合將抗腫瘤藥物或載藥體系選擇性地傳遞至腫瘤部位發(fā)揮藥效[16]。細(xì)胞穿膜肽是一種能夠穿透一切細(xì)胞膜的短肽鏈,無細(xì)胞選擇性。iRGD是一條同時(shí)具有RGD和穿膜肽作用的多肽,能夠識(shí)別整合素受體,同時(shí)高效發(fā)揮穿膜肽作用[17]。本研究將iRGD連接到脂質(zhì)體表面,從體內(nèi)外對其結(jié)腸癌靶向性進(jìn)行評價(jià)。

    本研究結(jié)果顯示:制備得到的脂質(zhì)體的粒徑為110 nm左右。本研究通過定性和定量的細(xì)胞攝取和熒光脂質(zhì)體的腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)來考察iRGD修飾的脂質(zhì)體與結(jié)腸癌細(xì)胞的親和力及對實(shí)體腫瘤的穿透作用,結(jié)果顯示:iRGD修飾的脂質(zhì)體具有良好的結(jié)腸癌細(xì)胞親和力和靶向性,經(jīng)過iRGD修飾后增強(qiáng)了脂質(zhì)體對實(shí)體瘤的穿透作用。本研究還構(gòu)建了結(jié)腸癌異位腫瘤模型,研究iRGD修飾脂質(zhì)體的體內(nèi)分布,結(jié)果顯示:經(jīng)過iRGD修飾后,脂質(zhì)體能夠更好的靶向至腫瘤組織。

    綜上所述,本研究制備的iRGD修飾脂質(zhì)體是一種潛在有效的結(jié)腸癌細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)。

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    (編校:吳茜)

    Preparation of iRGD modified liposome and its targeting to colon cancer cell

    ZHONG Ling1,2,LISi-qi3,YANGWei2,ZENG Rong2,MAO Qin2,CHEN Jia-yong3Δ

    (1.Kunming Medical University,Kunming 650500,China;2.Department of Emergency,The First People's Hospital of Yunnan Province,Kunming 650032,China;3.Department of Emergency,The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical
    University,Kunming 650101,China)

    ObjectiveTo prepare iRGDmodified liposome(iRGD-LP)and evaluate their targeting efficiency in vitro and in vivo to colon cancer cell.MethodsThe iRGD-LPwas prepared by film-ultrasonicmethod,its particle size and Zeta potentialwere evaluated.The cellular uptake efficiency of RKO cell to LP and iRGD-LPwere evaluated in vitro and in vivo.Tumor spheroid model were constructed and the penetration efficiency of solid tumor were evaluated.Ectopic colon cancer nudemicemodel was constructed,and iRGD-LP distribution in the rat body were studied.ResultsThe particle diameter of iRGD-LPwas(109.4±12.9)nm with the Zeta potential of(4.2±1.47)mV.The cellular uptake efficiency of RKO cell to iRGD-LP were 3.2 times higher than thatof LP(P<0.01).The tumor spheroid penetration testand iRGD-LP distribution in vivo imaging results showed iRGD-LP had the strongest fluorescence intensity.Conclusion The iRGD-LPmight serve as a promising colon cancer delivery system of antitumor drugs.

    colon cancer;liposome;drug targeting;iRGD

    R735.3

    A

    1005-1678(2014)07-0069-03

    云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2011FA029);云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金項(xiàng)目(2010CD165)

    鐘玲,女,博士在讀,研究方向:胃腸道腫瘤,E-mail:zhongl87189812@163.com;陳嘉勇,通信作者,男,碩士,主任醫(yī)師,研究方向:胃腸道腫瘤,E-mail:xiaosha.dogy@163.com。

    book=71,ebook=74

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