板藍根提取物對放射性肺損傷大鼠肺組織TGF-β表達水平的影響

鄭波，菅向東

（1.山東省交通醫(yī)院放射科，山東濟南650216；2.山東大學臨床醫(yī)學系，山東濟南250012）

板藍根提取物對放射性肺損傷大鼠肺組織TGF-β表達水平的影響

鄭波1，菅向東2

（1.山東省交通醫(yī)院放射科，山東濟南650216；2.山東大學臨床醫(yī)學系，山東濟南250012）

目的探討板藍根提取物對放射性肺損傷大鼠肺組織TGF-β表達的影響。方法將72只健康成年清潔級雌性Wistar大鼠隨機分為空白對照組(A組）24只，單純照射組(B組）24只，照射加中藥組(C組）24只，A、B 2組以蒸餾水2mL/200 g灌胃1周后，C組以每天2mL/200g(1.6 g/200 g）灌胃服用板藍根提取物1周，開始照射，照射期間，每周測體質(zhì)量1次，至照射結(jié)束。分別在完成10次照射后(第30天），以及在照射開始后的第60天、120天，分別檢測3組大鼠肺組織中TGF-β的表達；另外對各組大鼠進行肺組織形態(tài)學觀察。結(jié)果B組大鼠TGF-β的表達于照射第30天時達到高峰；A、C組大鼠TGF-β表達在各時間點均低于B組(P＜0.01）?？瞻讓φ战MA組大鼠肺組織未見明顯改變。B組大鼠肺間質(zhì)肺泡腔內(nèi)觀察到炎性細胞，肺泡腔結(jié)構(gòu)破壞、肺間質(zhì)水腫，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)炎性出血；C組大鼠肺間質(zhì)炎性細胞較少，肺泡腔破壞不明顯，無肺間質(zhì)水腫，也無炎性出血癥狀發(fā)生，B、C 2組間比較不明顯。結(jié)論板藍根提取物可減少放射性損傷大鼠肺成纖維細胞TGF-β表達，可減少放射性肺損傷的功效。具有保護肺組織不受損害，抑制肺泡通透性，預防肺水腫發(fā)生的作用。

板藍根提取物；放射性肺損傷；轉(zhuǎn)化生長因子-β

放射性肺損傷主要是由放射治療引起的，是胸部腫瘤放療 患者中常見的并發(fā)癥。放射照射引發(fā)放射性肺纖維化和放射性肺炎［1］。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）影響肺成纖維細胞的增殖而破壞肺組織結(jié)構(gòu)。西醫(yī)對放射性肺損傷主要以預防為主，通過減少照射劑量來控制發(fā)病率，但引起肺損傷仍然不可避免。治療方面西醫(yī)運用糖皮質(zhì)激素和抗生素治療，但效果不甚理想，往往誘發(fā)其它顯著不良反應［2］。中醫(yī)藥如百靈膠囊、當歸、麥門冬湯等在治療放射性肺損傷方面，具有一定療效，能夠延緩放射性肺纖維化，相關(guān)臨床研究已經(jīng)證實［3-5］。本實驗采用預先給予小劑量多次照射大鼠造模，觀察含有苯丙素類，酚酸類化合物的板藍根提取物對放射性肺損傷大鼠肺組織TGF-β表達水平影響，觀察其對照射后肺組織的保護作用，尋求預防放射性肺炎及纖維化有效的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物：無特定病原體的健康成年清潔級雌性Wistar大鼠72只，體質(zhì)量（200±40）g，由湖北省疾病預防控制中心提供，合格證號SCXK（鄂）201342006。實驗前在動物房飼養(yǎng)4 d，飲水飼料無限制，飼養(yǎng)溫度室溫、自然光照，無特殊異常者作為備選進行實驗。本次大鼠實驗操作流程都遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 實驗試劑和儀器：TGF-β（1：500）為兔親和純化多克隆抗體，為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。山羊或兔SPkit及DAB（編號3R058）染色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；10%甲醛及水合氯醛為附屬醫(yī)院提供。板藍根提取物為本實驗制備。顯微鏡為奧林巴斯BX53型顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 板藍根提取物制備：用5～10倍的板藍根重量的20%～75%乙醇水溶液回流提取，過濾回收溶劑至無醇味，將濃縮液過D101大孔吸附樹脂，先用水洗脫至流出液無色或顏色較淺，再用20%～80%乙醇洗脫6個柱體積，收集洗脫液，噴霧干燥得提取物。

1.2.2 實驗分組與照射方法：將大鼠隨機分為3組，A組：空白對照組，B組：單純照射組，C組：照射加中藥組；A組大鼠10%水合氯醛麻醉后不進行照射；共照射B、C組48只大鼠，用10%水合氯醛麻醉腹腔后，取仰臥位。四肢固定于治療床上，充分曝露胸部，屏蔽頭部與腹部；調(diào)整照射機照射右側(cè)胸部，照射視野3.0 cm×1.8 cm，于大鼠前肢兩腋窩中點連線，下至劍突水平。放射參數(shù)為6MV光子。全肺單次照射劑量為3 Gy，3天1次，連續(xù)照射1個月。所有小鼠照射后無一只死亡。分別于照射開始第30、60、120天，3組隨機抽取8只處死、取材。

1.2.3 給藥方式：大鼠稱重后，A和B組大鼠以蒸餾水2mL/200 g體質(zhì)量灌胃，C組以每天2mL/200 g體質(zhì)量灌胃板藍根提取物，板藍根提取物與蒸餾水按1：8配置成懸浮液，制備成0.25 g/mL，A、B組每天給予蒸餾水繼續(xù)灌胃，C組大鼠灌胃給藥連續(xù)1周后，開始對B、C組進行射線照射。照射期間，每天觀察大鼠活動情況，周測稱量體質(zhì)量以調(diào)整給藥劑量。

1.2.4 檢測項目及方法：分別于照射第30、60、120天時間點，3組均隨機抽取8只大鼠，處死。迅速剖取大鼠胸腔，剪取右肺，置于10%甲醛溶液中固定24 h，適量酒精脫水，石蠟包埋后，進行石蠟切片，隨后免疫組織化學染色。每只大鼠取3張切片，陽性灶鏡下呈棕黃色，染色均勻，邊界清晰；每張切片在10×20倍顯微鏡下取3個視野，利用多功能真彩色形態(tài)學分析軟件分別測量細胞因子TGF-β的表達，測量單個視野內(nèi)陽性灶面積比。形態(tài)學檢查：取肺組織，用10%的甲醛固定，高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份，于60℃石蠟包埋，用切片機切成4μm厚的切片，切片放置載玻片上烘干，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學改變。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，各組間在同一時間點的差異性比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠各時間段肺組織免疫組化TGF-β表達檢測結(jié)果 TGF-β在A組的細支氣管血管上皮中有少量表達，但是各時間點基本一致，比較無差異性。照射第30天時，B組大鼠TGF-β開始表達增強，第60天時表達水平最高，隨后開始下降，至第120天時表達降低，但與A、C組比較仍然較高；A、C組大鼠TGF-β表達在各時間點均低于B組（P＜0.01），在第30天時，C組表達開始增加，但明顯低于B組（P＜0.01），與C組相比各時點表達均較低，與 A組比較各時間點水平有所升高（見表1、圖1）。

表1 各時間段大鼠肺組織TGF-β表達陽性面積Fig.1 Positive area of TGF-βin the lung tissue expression at each time

圖1 3組大鼠各時間段肺組織TGF-β表達Fig.1 TGF-βexpression in the lung tissue of rats in different three groups at each time

2.2 組織形態(tài)學觀察 空白對照組A組：大鼠肺組織未見明顯改變。B組單純照射組：大鼠肺間質(zhì)肺泡腔內(nèi)觀察到炎性細胞，肺泡腔結(jié)構(gòu)破壞、肺間質(zhì)水腫，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)炎性出血；C組照射加灌胃中藥組：大鼠肺間質(zhì)炎性細胞較少，肺泡腔破壞不明顯，無肺間質(zhì)水腫，也無炎性出血癥狀發(fā)生，各組間比較不明顯。其中C組和B組相比，肺組織炎性傷害較明顯改變，肺組織損壞程度明顯較少（見圖2）。

圖2 3組大鼠各時間段肺組織HE染色圖Fig.2 HE staining of lung tissue figure in three groups of rats at each time

3 討論

放射性肺損傷主要是肺組織受到射線照射引起的炎性損傷，受各種細胞因子的介導。相關(guān)研究報道指出，TGF-β、FGFs、FN、TNF-α、IL-6等是與放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而TGF-β在參與放射性肺損傷的細胞因子中占主導地位［6-8］。它通過刺激各種細胞外基質(zhì)成分的合成和沉積，抑制細胞外基質(zhì)降解而逐漸沉積。TGF-β是一種廣泛存在于多種組織中、具有多功能的細胞因子。體外實驗已經(jīng)證實TGF-β能直接增加內(nèi)皮單細胞層的通透性，把大鼠肺泡 H型上皮細胞單細胞層用TGF-β培養(yǎng)24 h后，可測得經(jīng)皮電阻降低，顯示肺泡上皮屏障破壞，使用小鼠TGF-β抗體預處理后能夠阻止肺泡上皮屏障的破壞。由此可見，TGF-β能直接增加肺泡上皮的通透性，對動物活體內(nèi)肺水腫的誘導起關(guān)鍵作用。文獻報道阿米福汀能增加肺組織對放射線的耐受［9］。無論哪一種藥物，其根本目的都在于抑制或延緩放射性肺纖維化，并盡可能在纖維化早期使其逆轉(zhuǎn)。在放射性損傷研究中，大劑量照射是一次性照射10～30 Gy，誘導動物出現(xiàn)急性炎癥，大鼠肺放射性損傷呈動態(tài)變化，從慢性炎癥逐漸變成肺泡間隔的纖維化。相關(guān)研究報道采用6 mV X，30 Gy照射，小鼠食道及呼吸道受到損傷導致結(jié)果有所偏差［10］。該模型的方法優(yōu)勢是易于操作，建模成功率高、穩(wěn)定可靠；缺陷是不能模擬臨床上多次小劑量照射引起放射性肺損傷的病理過程。小劑量造模通過模擬臨床小劑量、多次重復照射的實際情況，更與實際肺損傷病理癥狀類似，該方法逐漸被廣大醫(yī)學界醫(yī)生認可［11-12］。因此，該實驗運用小劑量多次照射形成造模的方法來評價板藍根提取物對放射性肺損傷小鼠的TGF-β表達水平［13］。

板藍根液治療流感有顯著療效，它通過多種機制相互作用，其發(fā)揮抗炎、解熱鎮(zhèn)痛作用的主要化學物質(zhì)是苯丙素類，酚酸類，有很好的清除自由基的能力，達到抗氧化、抗輻射損傷的作用；其中酚酸類能降低毛細血管的通透性，控制炎性物質(zhì)釋放，另外，增強吞噬細胞對炎性物質(zhì)的吞噬而增強機體的抗防御機能。苯丙素類物質(zhì)含有許多酚羥基，降低大鼠血漿粘度、具有改善微循環(huán)的作用；同時其提高血清SOD水平，從而阻止肺組織相關(guān)炎癥的發(fā)生，預防肺部纖維化，抑制肺內(nèi)膠原異常沉積化，減輕放射線對機體的損傷［14］。

本研究顯示，受到輻射影響B(tài)組大鼠射線照射肺組織中的TGF-β表達同對照（板藍根提取物組和空白對照組）相比均明顯增加，尤其是與單純照射組較，差異有統(tǒng)計學意義。照射后隨著時間延長，TGF-β在肺組織中的表達逐漸增強，說明TGF-β等細胞因子介導了早期炎癥反應［15］。在照射后期其水平更高，而TGF-β水平越高，放射性肺損傷發(fā)生的風險越高，患者發(fā)生炎癥和纖維化的程度也越高。板藍根提取物有效抑制了TGF-β的表達強度，減輕了肺纖維化的程度。而TGF-β水平在放療結(jié)束時接近正常水平，反映出發(fā)生放射性肺炎及纖維化的程度也較低［16-17］。上述結(jié)論可以通過形態(tài)學檢測結(jié)果進一步佐證，加服板藍根提取物的大鼠其肺部受損傷程度較少，控制炎癥發(fā)生，通過抑制TGF-β的表達強度，減輕肺纖維化。

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（編校：吳茜）

Effect of extraction of radix isatidis on the expression levels of TGF-βin lung tissues of rats w ith radioactive lung injury

ZHENG Bo1，JIAN Xiang-dong2

（1.Department of Radiology，Traffic Hospital of Shandong Province，Jinan 650216，China；2.Department of Clinical Medicine，Shandong University，Jinan 250012，China）

ObjectiveTo investigate the effectof extraction of radix isatidis on the expression of transforming growth factor（TGF-β）in lung tissues of rats with radioactive lung injury.Methods72 femaleWistar ratswere random ly divided into 3 groups，blank control group（groupA，n=24），simple irradiation group（group B，n=24），irradiation with Chinesemedicine group（group C，n=24）.Rats in group A and group B were given distilled water 2mL/200g by gavage for one week，the rats in group C were given extraction of radix isatidis 2mL/200g（1.6 g/200 g）per day for one week，then the rats received irradiation，during irradiation，the rats'weightwasmeasured once a week，to illuminate the end.After 10-time irradiation（the 30thday），and at60 days and at120 days after irradiation，the expression levels of TGF-βin lung tissuewere detected；In addition each rat lung tissuemorphology was observed.ResultsThe expression levels of TGF-βprotein in group B reached peak at the 30 days after irradiation，which at different time points in group A and group C was significantly lower than that in group B（P＜0.01）.Rats of group A had no significant change in lung tissue.Rats of group B were observed inflammatory cells in interstitial pulmonary alveolar，alveolar structural damaging，interstitial pulmonary edema，interstitial hemorrhage and inflammatory pulmonary with alveolar cavity；Rats of group C pulmonary interstitial fewer inflammatory cells in alveolar damage were not obvious，with no-pulmonary interstitial edema，hemorrhage and no inflammatory symptoms，comparison between group B and C was not obvious.ConclusionExtraction of radix isatidis could reduce the expression levels of transforming growth factor（TGF-β）in lung tissues of rats with radioactive lung injury，has better preventive effect on radioactive lung injury，could protect lungtissue from damaging，inhibite alveolar permeability，and present the effect of pulmonary edema.

extraction of radix isatidis；radioactive lung injury；transforming growth factor-β

R256

A

1005-1678(2014）07-0037-03

山東省自然科學基金（Y2008C123）

鄭波，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：醫(yī)學影像診斷、X線引導下介入治療，E-mail：qch1821460090@163.com。