葛根素對子癇前期樣大鼠胎盤組織中HIF-1α表達(dá)的影響

李彥玲，趙純

（1.山東省寧津人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東寧津253400；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

LIYan-ling1，ZHAO Chun2

（1.Ningjin People's Hospital of Shandong Province，Ningjin 2534002，China；2.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

葛根素對子癇前期樣大鼠胎盤組織中HIF-1α表達(dá)的影響

李彥玲1，趙純2

（1.山東省寧津人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東寧津253400；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

目的探討葛根素對子癇前期樣大鼠胎盤組織中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF）-1α表達(dá)的影響，研究其對大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。方法60只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、藥物(低、中、高劑量）組和模型組，每組各12只。藥物組和模型對照組采用內(nèi)毒素構(gòu)建子癇前期樣大鼠模型，低、中、高劑量組在模型組基礎(chǔ)上分別給予40.0、60.0、80.0mg/kg葛根素腹腔注射，觀察不同時間點大鼠尾動脈血壓、尿蛋白濃度，并采用RT-PCR檢測各組HIF-1α的表達(dá)水平。結(jié)果模型組大鼠收縮壓、尿蛋白濃度、胎盤中HIF-1α蛋白均明顯高于空白對照組，血漿NO濃度顯著低于空白對照組(P＜0.05）；葛根素干預(yù)后，各藥物干預(yù)組大鼠收縮壓、尿蛋白濃度均顯著低于模型對照組(P＜0.05），血漿NO濃度均顯著高于模型對照組(P＜0.05），且胎盤中HIF-1α蛋白顯著低于模型對照組(P＜0.05）；藥物干預(yù)組孕鼠胎盤重量、仔鼠體質(zhì)量及身長均顯著高于模型對照組(P＜0.05）。結(jié)論葛根素可有效降低大鼠收縮壓、尿蛋白濃度，增高血漿NO濃度并降低胎盤中HIF-1α蛋白，葛根素通過抑制胎盤組織中HIF-1α的表達(dá)對妊娠高血壓大鼠起保護(hù)作用。

葛根素；子癇前期；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

LIYan-ling1，ZHAO Chun2

（1.Ningjin People's Hospital of Shandong Province，Ningjin 2534002，China；2.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

子癇前期為妊娠期特發(fā)性疾病，發(fā)病率約占全部妊娠的3.9%，病變導(dǎo)致全身小動脈痙攣和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，致使多系統(tǒng)靶器官血流灌注減少，使孕婦出現(xiàn)多系統(tǒng)的臨床征象。在子癇前期的病理生理過程中，胎盤缺血缺氧學(xué)說目前在醫(yī)學(xué)界已得到廣泛關(guān)注。近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α在子癇前期胎盤組織中高度表達(dá)［1-2］，提示其可能參與子癇前期的病理過程。葛根素是治療血管性疾病的臨床藥物，其可改善心?。?］、神經(jīng)細(xì)胞［4］的缺血、缺氧狀態(tài)，可抑制子癇前期胎盤細(xì)胞的凋亡［5］，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究將探討葛根素對子癇前期的療效，并初步探討HIF-1α是否參與了該過程。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 葛根素注射液，北京四環(huán)科寶制藥公司生產(chǎn)，批號H20030299；內(nèi)毒素，美國Sigma公司產(chǎn)，純度99.9%；NO試劑盒，上海研晶生物科技有限公司。主要實驗儀器：上海精科751G分光光度劑，美國ABI公司ABI7500熒光定量PCR儀，南京德賽生物技術(shù)有限公司BESN-IIA6動物多通道無創(chuàng)測壓系統(tǒng)。

1.2 PIH大鼠模型的構(gòu)建及分組 清潔SD級，體質(zhì)量200～250 g，標(biāo)準(zhǔn)潔凈環(huán)境下喂養(yǎng)。實驗嚴(yán)格遵守國家衛(wèi)生研究院（NIH）實驗動物飼養(yǎng)及使用指南。雌雄大鼠2：1分籠飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)陰道栓日為妊娠第1天。選取60只雌性大鼠為研究對象，隨機(jī)分為5組（每組12只），除空白對照外，藥物組（低、中、高劑量組）和模型對照組均于妊娠第14天起尾靜脈滴注內(nèi)毒素1.0 μg/（kg·d），輸注速度2mL/h，連續(xù)4 d；空白對照組同期給予同等劑量生理鹽水。

1.3 給藥方法 藥物組于妊娠第14～21天，每天腹腔注射不同濃度葛根素注射液，分別按40.0、60.0、80.0mg/kg腹腔注射于低、中、高劑量組大鼠，空白對照組和模型對照組給予同等劑量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)給藥至妊娠第21天。

1.4 檢測指標(biāo) 分別妊娠第19天，21天監(jiān)測大鼠尾動脈血壓、24 h尿蛋白含量和血漿NO濃度。①尾動脈血壓檢測：應(yīng)用多通道無創(chuàng)測壓系統(tǒng)測量大鼠尾動脈血壓，大鼠固定于30℃恒溫箱內(nèi)約10min，固定探極，通過尾部加壓套加壓阻斷血流，至尾動脈血流阻斷脈搏波消失，保持3～5 s后打開軟件，逐漸減小外加壓力至動脈搏動出現(xiàn)后，此時血壓記為該實驗動物的收縮壓。每只大鼠重復(fù)測量6次，時間間隔2min，取均值。②24 h尿蛋白含量：收集大鼠24 h尿液，采用比色法測定尿蛋白濃度。③血漿NO濃度：腹主動脈采血5mL，離心取上清，硝酸還原酶法測定吸光度值，換算為NO濃度。

1.5 PT-PCR測定大鼠胎盤HIF-1α蛋白的表達(dá) 妊娠第21天，25%烏拉坦麻醉下，剖腹取20 g胎盤，Trizol試劑提取總RNA，測定OD260和OD280，計算RNA的純度和含量。M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用熒光定量PCR檢測HIF-1αmRNA表達(dá)。南京生興生物技術(shù)有限公司合成引物，2-△△CT法分析結(jié)果。引物設(shè)計：HIF-1（上游引物：5'-GCGGCGCGAACGA-CAAGAAAAAG-3'，下游引物：5'-GAATGTGGCCT-GTGCAGTGCAATAC-3'；內(nèi)參βactin上游引物：5'-TGTGCCCATC-TACGAGGGGTATGC-3'，下游引物：5'-GGTACAT-GGTGGTGCCGCCAGAACA-3'）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計量資料采用“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法進(jìn)行。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對子癇前期樣大鼠收縮壓和尿蛋白濃度的影響 內(nèi)毒素藥物誘導(dǎo)后（D19天），模型組和各藥物組大鼠的收縮壓及尿蛋白均顯著高于空白對照組（P＜0.05），提示模型構(gòu)建成功。低、中、高劑量藥物組與模型組間模型構(gòu)建具有可比性。各藥物組給予不同濃度葛根素干預(yù)后4 d，各藥物組收縮壓均顯著低于模型組（P＜0.05），且隨著藥物劑量增加，收縮壓降低越明顯，高劑量組收縮壓明顯低于低劑量組（P＜0.05）；各藥物組尿蛋白濃度較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；尿蛋白含量在不同藥物組中亦呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；藥物干預(yù)后，各組大鼠血漿NO濃度普遍高于藥物干預(yù)前，且顯著高于模型組（P＜0.05，見表1）。

表1 不同組別子癇前期樣大鼠各時點收縮壓和尿蛋白濃度比較Tab.1 Comparison of systolic blood pressure and urine protein concentration in preeclampsia rats at different points

2.2 葛根素對孕鼠胎盤重量、仔鼠體質(zhì)量和身長的影響模型組大鼠胎盤重量、仔鼠體質(zhì)量及仔鼠身長均顯著低于空白對照組（P＜0.05）；中、高劑量組大鼠胎盤重量、仔鼠體質(zhì)量及仔鼠身長均顯著高于模型組（P＜0.05）；低劑量組大鼠胎盤重量、仔鼠體質(zhì)量及仔鼠身長雖高于模型對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表2）。

表2 不同組別子癇前期樣大鼠胎盤重量、新生鼠體質(zhì)量和身長比較Tab.2 Comparision of placenta weight in preeclampsia rats and weight，body length in offspring

2.3 葛根素對子癇前期樣大鼠胎盤中HIF-1α表達(dá)的影響

PT-PCR半定量分析檢測結(jié)果顯示：藥物組和模型組大鼠胎盤中HIF-1α蛋白表達(dá)均高于于空白對照組（P＜0.05），葛根素干預(yù)后藥物組HIF-1α蛋白表達(dá)水平均降低，其中中、高劑量組HIF-1α蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型對照組（P＜0.05），高劑量組HIF-1α蛋白表達(dá)水平低于低劑量組（P＜0.05，見圖1）。

圖1 葛根素對子癇前期樣大鼠胎盤中HIF-1α表達(dá)的影響1.空白對照組；2.模型對照組；3.低劑量組；4.中劑量組；5.高劑量組*P＜0.05，與空白對照組相比；△P＜0.05，與模型組相比；#P＜0.05，與低劑量組相比Fig.1 Impact of puerarin on expression of HIF-1αin preeclampsia rats1.Control group；2.Model group；3.Low-dose group；4.Medial-dose group；5.High-dose group *P＜0.05，compared with control group；△P＜0.05，compared with model group；#P＜0.05，compared with low-dose group

3 討論

子癇前期的病因涉及到免疫調(diào)節(jié)異常、滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙、內(nèi)皮損傷、遺傳及營養(yǎng)等多種病因機(jī)制，且存在多種因素交互作用［6］。在多病因?qū)W說中，滋養(yǎng)細(xì)胞增殖分化異常而導(dǎo)致的胎盤缺血、缺氧學(xué)說目前得到普遍關(guān)注。有國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在子癇前期，一種或多種因素的綜合作用使滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖分化與功能發(fā)生異常，由于高流量低阻力性螺旋動脈的重鑄能力不足，滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲力弱化，使其僅能侵入子宮壁，聚集在蛻膜淺層，同時被滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤的血管顯著減少，使胎盤絨毛缺血缺氧，血液灌注減少，這種胎盤的生理性重鑄障礙，導(dǎo)致胎盤“淺著床”，將抑制胎盤發(fā)育［7-8］。當(dāng)胎盤供血不足時，子宮—胎盤將處于缺血缺氧狀態(tài)，隨著胎盤缺血缺氧的加劇，最終會導(dǎo)致子癇前期—子癇的各種臨床癥狀［9-10］。

多種蛋白表達(dá)與子癇前期中胎盤缺血缺氧相關(guān)［11］。多種蛋白HIF-1α是一種具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，其包含的缺氧耐受適應(yīng)性靶基因譜在與相關(guān)靶基因結(jié)合后，通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控細(xì)胞的低氧適應(yīng)性變化，通過在缺氧條件下的穩(wěn)定表達(dá)，HIF-1α可提高機(jī)體的缺氧耐受能力，參與紅細(xì)胞生成，血管形成、能量代謝等生物學(xué)效應(yīng)［12］。近年來研究表明，HIF-1α對低氧反應(yīng)基因表達(dá)如轉(zhuǎn)化生長因子β3，胎盤生長因子，組織型纖溶酶原激活物等均發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用；同時，HIF所調(diào)控的基因如瘦素、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等與子癇前期密切相關(guān)，而HIF的自身調(diào)節(jié)也在子癇前期病理過程中發(fā)揮重要的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HIF的自調(diào)節(jié)因子HIF-1α在子癇前期胎盤組織中高度表達(dá)，肯定了其在子癇前期的病理過程的作用［13］。

葛根素是中藥葛根中的總黃酮提取物，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：葛根素可通過阻斷β受體降低鈣離子內(nèi)流、拮抗內(nèi)皮素、增加血小板中NO的生成等多種途徑調(diào)節(jié)血管張力，促使血流量增加［14-15］，顯示出良好的抗血小板聚集、擴(kuò)張小動脈、改善微循環(huán)及血液流變學(xué)的作用。子癇前期病例中存在血管內(nèi)皮損傷，NO表達(dá)上調(diào)［16］。本組研究證實：葛根素具有明顯的改善血壓、尿蛋白及促進(jìn)幼鼠的發(fā)育成熟的作用，提示葛根素在改善胎盤血管張力，改善細(xì)胞缺氧缺血狀況中具有良好效果。同時研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可提高血漿中NO濃度，降低HIF-1α蛋白的的表達(dá)水平。從其作用機(jī)理上，有國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在正常氧濃度下，NO可通過疏基亞硝基化作用誘導(dǎo)HIF-1αDNA的結(jié)合活性和靶蛋白表達(dá)，使HIF-1α蛋白穩(wěn)定并且增加HIF-1β蛋白的表達(dá)；而在缺血缺氧條件下，血管內(nèi)皮中的乳酸脫氫酶的釋放量增加，誘導(dǎo)丙二醛合成增多，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的流行性增高，使NO水平降低，在此情況下，NO可調(diào)控HIF-1α蛋白巰醇基的修飾，來調(diào)節(jié)HIF-1α的蛋白表達(dá)；另外，NO也通過穩(wěn)定HIF-1α的蛋白表達(dá)來刺激VEGF的表達(dá)［17-18］。

綜上所述，葛根素可有效降低子癇前期模型大鼠血壓、尿蛋白含量，提高血漿NO濃度，抑制胎盤組織中HIF-1α水平，葛根素所發(fā)揮的保護(hù)作用可能是通過上調(diào)NO濃度來穩(wěn)定HIF-1α水平。

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（編校：吳茜）

Effect of puerarin on the expression of HIF-1αin placenta of rats w ith preeclampsia

ObjectiveTo investigate the effect of puerarin on preeclampsia-like rat placental tissue hypoxia inducible factor（hypoxia-inducible factor，HIF）-1αexpression and study themechanism of protective effects in rats.Methods60 SD ratswere random ly divided into control group，drugs intervention groups（low-dose，middle-dose，high dose）and model group.The rats in drugs intervention groups and model group were adopted endotoxin for induction of preeclampsiamodel.On the basis of themodel group，low，medium and high dose groupswere given 20.0，40.0，60.0mg/kg puerarin by intraperitoneal injection，respectively.The blood pressure of tail artery，urine protein concentration were observed at different points and the expression of HIF-1αwere detected by PT-RCT in each group.ResultsThe systolic blood pressure，urine protein and HIF-1αprotein in model group were higher than control group（P＜0.05）；serum NO concentration was lower than control group（P＜0.05）；after the puerarin intervention，systolic blood pressure and urine protein concentration in drugs intervention groups were lower than model group（P＜0.05），plasma NO concentration was higher than model group（P＜0.05）and HIF-1αprotein was lower than model group（P＜0.05）；the placenta weight，weight and body length of newborn rats in drug intervention group were higher than model group（P＜0.05）.ConclusionPuerarin can reduce systolic blood pressure and urine protein levels，promote the level of NO in plasma and reduce HIF-1αlevel in placenta of rats.Puerarin can offer protection to ratswith preeclampsia by decreasing the expression of HIF-1αin placental.

puerarin；preeclampsia；hypoxia-inducible factor-1α

R453.9

A

1005-1678(2014）07-0031-04

國家自然科學(xué)基金（81000258）。

李彥玲，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科疾病的診斷和治療，E-mail：lbj8001@163.com。