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    全反式維甲酸對U251細(xì)胞系增殖和MAPK信號通路的影響

    2014-09-13 07:14:38師麗娜臧峰周國平
    中國生化藥物雜志 2014年7期
    關(guān)鍵詞:維甲酸細(xì)胞系膠質(zhì)瘤

    師麗娜,臧峰,周國平

    (1.淄博市第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)科,山東淄博255200;2.淄博市第一醫(yī)院普外科,山東淄博255200;3.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇南京210029)

    全反式維甲酸對U251細(xì)胞系增殖和MAPK信號通路的影響

    師麗娜1,臧峰2,周國平3

    (1.淄博市第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)科,山東淄博255200;2.淄博市第一醫(yī)院普外科,山東淄博255200;3.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇南京210029)

    目的探討全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)對U251細(xì)胞系增殖和MAPK信號通路的影響。方法使用不同濃度的ATRA溶液對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251進(jìn)行孵育,檢測ATRA對U251細(xì)胞增殖的影響,并通過qRT-PCR與Western blot方法檢測MKPs與MAPK信號通路中各蛋白的變化。結(jié)果與對照組相比,ATRA可以有效的抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖,并且具有濃度依賴性。qRT-PCR結(jié)果顯示,采用不同濃度ATRA孵育48h后,MKPsmRNA的表達(dá)發(fā)生改變,但是MKP-5變化情況與下調(diào)67LR表達(dá)時不同,說明2種方法對MAPK信號通路作用的主要區(qū)別是對MKP-5的調(diào)控。Western blot實(shí)驗結(jié)果表明,ATRA孵育48h后,MAPK信號通路中各蛋白的磷酸化發(fā)生變化,說明ATRA通過控制MAPK信號通路中蛋白的磷酸化程度對U251細(xì)胞系進(jìn)行調(diào)控。結(jié)論維甲酸通過與不同的維甲酸受體相結(jié)合,發(fā)揮其生理作用,對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251進(jìn)行調(diào)控。ATRA可通過降低磷酸化ERK1/ 2的表達(dá)來抑制腫瘤的增殖,且能調(diào)控3種蛋白的磷酸化,說明MAPK信號通路在腫瘤增殖過程中發(fā)揮重要作用。

    膠質(zhì)瘤;67LR;ATRA

    全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)與受體通過配體結(jié)合區(qū)域相互結(jié)合,作用于靶基因。這是維甲酸類藥物作用的經(jīng)典途徑。維甲酸結(jié)合受體包含DNA結(jié)合區(qū)域,可以識別基因組DNA的特異性序列[1]。維甲酸靶基因啟動子序列中包含有維甲酸受體反應(yīng)元件,通過受體和靶基因之間不同的作用方式,維甲酸類藥物可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中不同基因或酶的表達(dá),使其活化或抑制,從而達(dá)到治療目的[2-4]。目前研究證實(shí)維甲酸還可以通過受體抑制轉(zhuǎn)錄活性因子AP-1(活性蛋白-1)途徑抑制某些細(xì)胞增殖[5]。通常它的活性形式為Jun與Fos家族成員的同源或異源異二聚體,能夠刺激腫瘤的形成,在腫瘤的侵襲與浸潤中起到關(guān)鍵作用。維甲酸類藥物可以與c-Jun(屬于活性蛋白-1)相互作用,導(dǎo)致其失活,而實(shí)驗證明AP-1的表達(dá)抑制可以抑制腫瘤的形成[6]。

    ATRA不僅具有抑制腫瘤生長的作用,在阻斷腫瘤的血管生成中也扮演著重要的角色。腫瘤組織新生血管的生成與癌組織侵襲、轉(zhuǎn)移程度成正比[7]。有研究表明ATRA可以明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖,下調(diào)TGF-β基因表達(dá),降低血纖維蛋白酶原激活物的活性,使血纖維蛋白酶原激活物抑制物PAI-1的表達(dá)上調(diào)[8]。此外ATRA可以減少原膠原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,纖維結(jié)合素的合成,從而降低了腫瘤細(xì)胞的移動能力[9]。

    維甲酸通過與不同的維甲酸受體相結(jié)合,發(fā)揮其生理作用,因此它對于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜。MAPK信號通路中蛋白的磷酸化表明,ATRA與67LR不同,不僅降低磷酸化ERK1/2的表達(dá)來抑制腫瘤的增殖,而且對3種蛋白的磷酸化全部產(chǎn)生調(diào)控,因此其作用機(jī)制會更加復(fù)雜,同時也說明MAPK信號通路在腫瘤增殖過程中扮演著至關(guān)重要的角色,在此背景下,本文深入地探討了維甲酸對U251細(xì)胞系增殖和MAPK信號通路的影,以期能為將來的研究提供一些參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗細(xì)胞與標(biāo)本 人惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251購自中國科學(xué)院生命科學(xué)研究院。膠質(zhì)瘤標(biāo)本及正常腦組織對照標(biāo)本均取自仁濟(jì)醫(yī)院。

    1.2 實(shí)驗試劑與藥品 混合纖維素酯微孔濾膜(0.22 μm),細(xì)胞培養(yǎng)用細(xì)菌過濾器(100 mm)(上海百特)。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,35 mm培養(yǎng)皿,60 mm培養(yǎng)皿,15 mL無菌尖頭離心管,50 mL無菌尖頭離心管(Corning)。

    青霉素,鏈霉素,DMEM,胎牛血清,胰蛋白酶,DMSO,poly-D-lysine,DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基11995(Gibco)。X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent(Roche)。多聚甲醛,TritonX-100,異丙醇,瓊脂糖,氯仿(華美)。DNAMarkers,TotalRNA Extractor-Trizol[生工?生物工程(上海)有限公司]。PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time,SYBR?Premix Ex Taq:trademark:GC(Perfect Real Time),PCR DNA Markers,T4 DNA Ligase,StuⅠ酶(TaKaRa公司)。Silen CircleTMRNAi Transcription Kit(美國綠陽公司)。Cell Counting Kit-8(DOJINDO公司)。ECL試劑(Millipore公司)。Western及IP細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。DH5α感受態(tài)細(xì)菌、質(zhì)粒小抽試劑盒、質(zhì)粒無內(nèi)毒素大抽快速提取試劑盒(TIANGEN)。

    一抗:兔抗人ERK1/2、p38、JNK,磷酸化ERK1/2,磷酸化p38以及磷酸化JNK;多克隆抗體(Cell Signaling)。小鼠抗人67LR單克隆抗體(Abcam?)。二抗:連有過氧(化)物酶的羊抗兔-IgG,連有過氧(化)物酶的羊抗小鼠-IgG(KANG CHEN)。

    1.3 實(shí)驗方法

    1.3.1 ATRA溶液配制:①稱取100 mg維甲酸粉末溶于332.845mL無水乙醇;②使用孔徑為0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾;③密封,-70℃避光保存,母液濃度為1000μM;④使用時,用無血清培養(yǎng)基稀釋至需要的濃度,現(xiàn)配現(xiàn)用。

    1.3.2 細(xì)胞分組和ATRA處理:①使用無血清培養(yǎng)基對ATRA母液進(jìn)行稀釋,配制成工作液,濃度分別為0.1μM,0.5 μM,1μM,5μM,10μM,50μM,6個濃度;②從培養(yǎng)箱中取出24 h前接種的細(xì)胞,吸去培養(yǎng)基;③依次向細(xì)胞中加入不同濃度的ATRA溶液(依據(jù)培養(yǎng)板的大小,選擇加入ATRA溶液的體積);④將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中,細(xì)胞在37℃,5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)48 h后,進(jìn)行后續(xù)試驗。實(shí)驗分7組,A組為空白對照組,未進(jìn)行ATRA孵育;實(shí)驗組分為B組以50μM濃度孵育U251細(xì)胞;C組以10μM濃度孵育U251細(xì)胞;D組5 μM濃度孵育U251細(xì)胞;E組以1μM濃度孵育U251細(xì)胞;F組以0.5μM濃度孵育U251細(xì)胞;G組以0.1μM濃度孵育U251細(xì)胞。

    1.3.3 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:將含細(xì)胞的凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出,立即置于40℃水浴中輕輕振蕩1min左右,使凍存液溶解,從水浴中拿出,噴灑70%乙醇后,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基中,離心收集細(xì)胞沉淀,加培養(yǎng)基混勻,移入培養(yǎng)皿中。37℃,5%CO2培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,更換新培養(yǎng)液;加入2mL新鮮培養(yǎng)液,用槍輕輕吹打,再加入適量培養(yǎng)液以易于混勻細(xì)胞;取1mL細(xì)胞懸液加入裝有2 m L新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿中,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約3 d左右傳代1次;從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板,并吸凈培養(yǎng)基,再將已孵育好的復(fù)合物加入到每一個待轉(zhuǎn)細(xì)胞的孔中,每孔50μL,輕輕前后搖動培養(yǎng)板混合。細(xì)胞在37℃,5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)48 h,觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并拍攝熒光以及常光照片。

    1.3.4 細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗:在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100μL/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)(37℃,5%CO2);待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%時,使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染;48 h后,取出培養(yǎng)板,向每孔中加入6.5μL的CCK-8溶液;將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱內(nèi),孵育4h;用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

    1.3.5 Quantitative real-time PCR:將總RNA溶液吸取1~2μL置于Nanodrop 2000的探頭上,閉合探頭,開始測定,得到260 nm和280 nm波長分別測吸光值(A)與A260/A280的值以及RNA溶液的濃度;使用Graph Prism 5.0軟件計算mRNA的相對表達(dá)量。

    1.3.6 Western blot:用PBST清洗封閉后的膜4次,每次5min,盡量不要有殘余物;加入一抗室溫孵育2 h后,用PBST清洗3次,每次5min;加入二抗室溫孵育1 h后,用PBST清洗3次,每次5min;顯色:取ECL試劑盒中試劑A和試劑B各500μL,混勻后,潤濕膜,使其反應(yīng)1min;將膜放入壓片盒中,用X感光片感光約5~60 s。經(jīng)顯影、停影、定影和水洗后,晾干。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗結(jié)果用Graph Prism 5.0軟件定量分析。實(shí)驗結(jié)果用“±s”表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ATRA孵育對U251細(xì)胞系的影響 結(jié)果顯示,在完全相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h,未做任何處理的空白對照組(圖1A)的OD值為(2.27312±0.0815),ATRA孵育濃度為50 μM的實(shí)驗組(圖1B)OD值為(0.185±0.073),2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);0.1μM濃度的實(shí)驗組的OD值(2.302±0.094),相比空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明:ATRA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251的生長、增殖有明顯的抑制作用,并且具有濃度依賴性。

    圖1 不同濃度ATRA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的影響A:空白對照組;B:50μM濃度孵育48 h;C:10μM濃度孵育48 h;D:5μM濃度孵育48 h;E:1μM濃度孵育48 h;F:0.5μM濃度孵育48 h;G:0.1μM濃度孵育48 h標(biāo)尺為50μmFig.1 Effects of different concentrations of ATRA on glioma cell U251A:control group;B:50μM ATRA with 48 h;C:10μM ATRA with 48 h;D:5μM ATRA with 48 h;E:1μM ATRA with 48 h;F:0.5μM ATRA with 48 h;G:0.1μM ATRA with 48 h Barmeans 50μm

    2.2 qRT-PCR分析ATRA孵育對MKPs的影響 使用qRT-PCR分析ATRA孵育48h后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中4類MKPs的mRNA的變化如圖2。結(jié)果表明,MKP-1的mRNA表達(dá)在ATRA濃度為1μM時,達(dá)到最大值,但是隨著ATRA濃度的繼續(xù)增大,MKP-1 mRNA的表達(dá)出現(xiàn)了顯著的下降。結(jié)果表明,ATRA在發(fā)揮抑制腫瘤生長作用時會引起MKPs各成員mRNA表達(dá)的變化,提示ATRA可能通過MAPK信號通路抑制U251細(xì)胞系的增殖。

    2.3 Western blot檢測ATRA孵育后對MAPKs的影響 為進(jìn)一步研究ATRA對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中MAPK信號通路中各蛋白及其磷酸化的影響,使用Western blot來進(jìn)行檢測ATRA孵育48h之后ERK1/2,p38,SAPK/JNK,磷酸化ERK1/2,磷酸化p38與磷酸化SAPK/JNK的蛋白變化情況[10]。如圖3所示,β-actin為內(nèi)參,CON為空白對照組。

    圖3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中MAPKs各蛋白與磷酸化MAPKs各蛋白的表達(dá)變化Fig.3 Expressin changes of proteins and phosphorylated proteins of MAPKs in glioma cell line U251 in vitro

    當(dāng)以不同濃度ATRA孵育48 h之后,ERK1/2,p38,SAPK/ JNK的總蛋白量并沒有出現(xiàn)大的變化,但是磷酸化ERK1/2,磷酸化p38與磷酸化的SAPK/JNK的表達(dá)情況卻出現(xiàn)了明顯的差異,磷酸化ERK1/2在0.5與1.0μM時都表現(xiàn)出明顯的下降,但是當(dāng)ATRA的濃度為5μM時,磷酸化ERK1/2出現(xiàn)了明顯的升高,說明負(fù)責(zé)調(diào)控ERK1/2磷酸化的MKPs表達(dá)在ATRA濃度為5μM時,出現(xiàn)下降,此結(jié)果與前面的研究一致。當(dāng)孵育濃度達(dá)到10μM時磷酸化ERK1/2的表達(dá)繼續(xù)出現(xiàn)下降,而且細(xì)胞的增殖能力也出現(xiàn)明顯降低,說明ERK1/2的磷酸化與U251細(xì)胞的增殖密切相關(guān),ERK1/2磷酸化的減弱會抑制U251細(xì)胞的增殖;磷酸化p38的表達(dá)僅在ATRA濃度達(dá)到10μM時,出現(xiàn)明顯下調(diào);磷酸化SAPK/JNK的情況比較復(fù)雜,在不同濃度時,都會呈現(xiàn)出不同的磷酸化情況,但當(dāng)孵育濃度為0.5μM時,去磷酸化作用明顯。這一結(jié)果說明,隨著ATRA濃度的變化,MAPK信號通路中各蛋白通過不同的磷酸化程度調(diào)控細(xì)胞的生理功能。

    3 討論

    在ATRA孵育的情況下,U251細(xì)胞的增殖也呈現(xiàn)出被抑制的趨勢,并且具有濃度依賴的特點(diǎn)。由于未進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測,ATRA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、增殖產(chǎn)生抑制的機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

    為了研究ATRA孵育對MAPK信號通路的影響,在不同濃度ATRA孵育的情況下,本研究使用qRT-PCR與Western blot檢測MKPs與MAPKs的表達(dá)變化。結(jié)果表明,當(dāng)ATRA濃度為0.1 μM時,U251細(xì)胞無論在增殖,細(xì)胞數(shù)量還是細(xì)胞形態(tài)方面,同空白對照組相比,均未出現(xiàn)明顯差異;當(dāng)ATRA濃度達(dá)到50μM時,幾乎不存在具有活性U251細(xì)胞,因此在qRT-PCR與Westernblot檢測中,選取0.5μM,1.0μM,5.0μM與10.0μM 4個濃度,進(jìn)行孵育。結(jié)果顯示,MKP-5的情況與下調(diào)67LR基因時不同:ATRA濃度越高,mRNA的表達(dá)越少;但是MKP-3與PAC1的情況與下調(diào)67LR基因時一致。說明2種方法雖然均可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,但對MAPK信號通路的作用并不相同,而其中主要的區(qū)別在于對MKP-5mRNA(或與MKP-5同屬一類的MKPs)表達(dá)的調(diào)控。Western blot的結(jié)果表明ATRA對于MAPK信號通路的調(diào)控不單純的局限于控制磷酸化ERK1/2的表達(dá),對磷酸化p38與磷酸化SAPK/JNK都起到調(diào)控的作用,這一結(jié)果提示,ATRA與67LR可能對MAPK信號通路的調(diào)節(jié)會產(chǎn)生交互作用,但是對腫瘤細(xì)胞增殖的影響,需要進(jìn)一步深入研究。

    下調(diào)67LR與ATRA孵育對MAPK信號通路中MKP-1的表達(dá)也不同。當(dāng)ATRA濃度為1μM時,達(dá)到最大值,但在5μM時出現(xiàn)明顯的下降,說明ATRA對于MKP-1 mRNA表達(dá)的調(diào)控可能存在一種反饋抑制的機(jī)制,當(dāng)ATRA溶液達(dá)到一定濃度時,導(dǎo)致MKP-1 mRNA表達(dá)的抑制。表明ATRA與67LR通過MAPK信號通路對腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控的分子機(jī)制不同。

    維甲酸通過與不同的維甲酸受體相結(jié)合,發(fā)揮其生理作用,因此它對于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜[11]。MAPK信號通路中蛋白的磷酸化表明,ATRA與67LR不同,不僅降低磷酸化ERK1/2的表達(dá)來抑制腫瘤的增殖,而且對3種蛋白的磷酸化全部產(chǎn)生調(diào)控,因此其作用機(jī)制會更加復(fù)雜[12],同時也說明MAPK信號通路在腫瘤增殖過程中有著重要作用。

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    (編校:吳茜)

    Retinoic acid incubation effect on proliferation of U251 cell line and effect on MAPK signal pathway

    SHILi-na1,ZANG Feng2,ZHOU Guo-ping3

    (1.Department of Medical Services,the First Hospital of Zibo City 255200 China;2.Department General Surgery,the First Hospital of Zibo City 255200 China;3.Nanjing Medical University,Nanjing 210029 China)

    ObjectiveTo investigate the retinoic acid incubation effect on proliferation of U251 cell line and effect on MAPK signal pathway.MethodsATRA solution of different concentration on the U251 glioma cells were incubated,the influence of ATRA on the proliferation of U251 cells were detected,and the proteins of MKPs and MAPK signaling pathwayswere detected by qRT-PCR and Western blot.Using Graph Prism 5 software for quantitative analysis ofexperimental results.ResultsCompared with control group,ATRA could effectively inhibit the proliferation of U251 glioma cells,in a concentration dependentmanner.QRT-PCR results showed that,different concentrations of ATRA after incubation for 48 hours,the expression of MKPsmRNA changed,but the changes of MKP-5 and expression of67LR was different,explained themain differences between the twomethods of the MAPK signaling pathway was the regulation of MKP-5.Western blot results showed that the ATRA,after 48 hours of incubation,the protein MAPK pathway had changed in phosphorylation,which showed that ATRA protein in the MAPK signaling pathway through control of the degree of phosphorylation on U251 cell line regulation.ConclusionRetinoic acid and retinoic acid receptor play its physiological effects and regulate human glioma cell line U251proliferation through different combination.Retinoic acid could not only reduce the expression of phosphorylated ERK1/2 to inhibit tumor proliferation,but also regulate three kinds of protein phosphorylation,therefore itsmechanism will be more complex,at the same time that the MAPK signaling pathway plays a crucial role in tumor proliferation process.

    glimoa;67LR;ATRA

    R739.41

    A

    1005-1678(2014)07-0019-04

    國家自然科學(xué)基金(81170611)

    師麗娜,女,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:血液病學(xué),E-mail:qch1821460063@163.com。

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