白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的抑制作用及其效應(yīng)機(jī)制分析

趙丹懿，戴朝霞，陳駿，李丹Δ，高文濤

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，遼寧大連116023；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的抑制作用及其效應(yīng)機(jī)制分析

趙丹懿1，戴朝霞1，陳駿1，李丹1Δ，高文濤2

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，遼寧大連116023；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

目的通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，觀察白藜蘆醇(resveratrol，Res）對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖抑制作用，并對(duì)其抑癌的可能效應(yīng)機(jī)制進(jìn)行分析。方法實(shí)驗(yàn)中設(shè)4個(gè)Res藥物組，終濃度分別為12.5、25、50、100μmol/L，同時(shí)設(shè)置不含Res藥物的對(duì)照組，采用MTT法測(cè)試Res對(duì)體外培養(yǎng)肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖抑制作用，反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR）檢測(cè)Bcl-2 mRNA的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)，ELISA測(cè)定Res對(duì)荷瘤小鼠細(xì)胞因子水平的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比，Res可以呈劑量和時(shí)間依賴性方式抑制肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖和Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達(dá)(P＜0.05）。同時(shí)Res能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并能明顯升高荷瘤小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平(P＜0.05）。結(jié)論Res體內(nèi)與體外對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402均有明顯的增殖抑制活性，其抗腫瘤的效應(yīng)機(jī)制可能與其下調(diào)Bcl-2的表達(dá)和提高細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12及TNF-α的水平有關(guān)。

白藜蘆醇；肝癌細(xì)胞Bel-7402；抑制作用；效應(yīng)機(jī)制

肝癌是一種十分常見的惡性消化道腫瘤，其病死率高、危害性大，已經(jīng)位居世界腫瘤性疾病的第3位，且有逐年升高的趨勢(shì)［1-3］。中國(guó)是肝癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病人數(shù)約占全世界總發(fā)病數(shù)的一半，而其死亡率也位居世界之首［4］。目前，治療肝癌的首選方法是進(jìn)行手術(shù)切除，約有40%的肝癌患者均采用手術(shù)切除治療［5］。近年來(lái)，隨著外科手術(shù)技術(shù)的快速發(fā)展，肝癌的手術(shù)治療效果也在一定程度上得到改善。但是，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率相當(dāng)高，5年后復(fù)發(fā)率高達(dá)80%左右，患者的總體生存率并未得到明顯提高［6］。因此，尋找和開發(fā)高效低毒的抗肝癌藥物具有十分重要的意義。白藜蘆醇（resveratrol，Res）作為一種天然的多酚化合物，廣泛存在于葡萄、花生等天然植物中，具有顯著的抗炎、抗自由基和抑制血小板凝聚等作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病也有一定的預(yù)防作用［7］。有研究表明，Res能夠抑制體外培養(yǎng)的多種人腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)對(duì)移植在小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞也顯示出一定的增殖抑制活性［8］。目前，Res在治療肝癌方面也有一定的研究，并顯示出良好的應(yīng)用前景，但其具體的作用機(jī)制并不十分清楚。本研究通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，觀察白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖抑制作用，并對(duì)其抑癌的可能效應(yīng)機(jī)制進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 白藜蘆醇（Sigma公司，美國(guó)）；DMEM培養(yǎng)基、FBS胎牛血清（Hyclone公司，美國(guó)）；MTT噻唑藍(lán)（Amresco公司，美國(guó)）；Trizol RNA試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄酶（NEB公司，美國(guó)）；Taq DNA聚合酶（東盛生物科技有限公司，中國(guó)）；人Bcl-2單克隆抗體（中衫金橋公司，中國(guó)），羊抗兔二抗（DAKO公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 肝癌細(xì)胞Bel-7402購(gòu)于美國(guó)ATTC公司，Bel-7402荷瘤小鼠購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：S015732-21。

1.3 方法

1.3.1 肝癌Bel-7402細(xì)胞體外培養(yǎng)：Bel-7402細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素105IU/L、鏈霉素100mg/L的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞融合到85%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化，傳代［9］。

1.3.2 MTT比色法測(cè)定肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，再加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的Res藥物100μL，Res的最終濃度為12.5、25、50、100 μmol/L，共4組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不含Res藥物的對(duì)照組，也設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h和48 h后，每孔加入25 μL的MTT噻唑藍(lán)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心棄去培養(yǎng)液，再每孔加入150μL的DMSO，于搖床上振搖10 min，充分溶解生成的結(jié)晶，然后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組的光吸收值（OD值），重復(fù)3次，取均值。用下面的公式計(jì)算各組藥物的細(xì)胞的抑制率［10-11］：抑制率=（1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)肝癌Bel-7402細(xì)胞Bcl-2 mRNA的表達(dá)：肝癌Bel-7402細(xì)胞用Res作用培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，然后提取各組細(xì)胞總RNA，再立刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20℃的冰箱保存?zhèn)溆谩cl-2 mRNA的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)操作按照RT-PCR試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，反應(yīng)體系為50μL，94℃下先預(yù)變性5 min，然后按照94℃30 s，56℃60 s，72℃120 s，反復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸10min。然后取RT-PCR的產(chǎn)物10μL進(jìn)行電泳，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用puc Mix Marker，使用凝膠掃描系統(tǒng)掃描目的基因和β-actin基因的光密度值，目的基因光密度與β-actin基因光密度的比值反映該目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)肝癌Bel-7402細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)：肝癌Bel-7402細(xì)胞用Res作用培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，然后提取各組細(xì)胞蛋白。取煮沸后的蛋白質(zhì)樣品用SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至Millipore膜。用脫脂奶粉封閉1 h后，用Bcl-2單克隆抗體孵育，緊接著用二抗孵育，采用ECL放射自顯影。最后將膠片掃描，分析目標(biāo)帶的分子量和光密度值，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，2者光密度比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 肝癌Bel-7402荷瘤小鼠建模：將正常培養(yǎng)的肝癌Bel-7402細(xì)胞制成懸液，注射進(jìn)80只小鼠體內(nèi)。然后隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各40只。實(shí)驗(yàn)組小鼠再分為4組，每組各10只，按照25、50、100、200mg/kg的Res劑量進(jìn)行灌胃，對(duì)照組每日用相同體積的蒸餾水灌胃。每隔1周測(cè)量腫瘤的體積。

1.3.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子水平：采用雙抗體夾心法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有資料行正態(tài)分布檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s”表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位間距M（Q3-Q1）表示；正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)，樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)試Res對(duì)體外培養(yǎng)肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖抑制作用 由圖1可知，與對(duì)照組相比，Res呈劑量和時(shí)間依賴性抑制體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖（P＜0.05）。由圖2可知，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，密度大，Res組的細(xì)胞，隨著濃度的不斷增大，Bel-7402細(xì)胞出現(xiàn)了典型的凋亡特征：細(xì)胞的染色質(zhì)固縮，且出現(xiàn)了凋亡小體。

圖1 Res對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖抑制Fig.1 The inhibition of Res on Bel-7402

圖2 不同濃度Res作用48 h后肝癌Bel-7402細(xì)胞的形態(tài)變化（SP×400）A：對(duì)照組細(xì)胞；B：12.5μmol/L Res組；C：25μmol/L Res組；D：50μmol/L Res組；E：100μmol/L Res組Fig.2 Themorphological changes of Bel-7402 cells after 48 h of different concentrations of Res（SP×400）A：Control group；B：12.5μmol/L Res group；C：25μmol/L Res group；D：50μmol/L Res group；E：100μmol/L Res group

2.2 RT-PCR法檢測(cè)Res對(duì)體外培養(yǎng)肝癌Bel-7402細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 使用RT-PCR法檢測(cè)對(duì)照組和Res組Bel-7402細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的表達(dá)情況。由圖3檢測(cè)結(jié)果所示，Res組Bcl-2 mRNA的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，其中100μmol/L Res組表達(dá)最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 Res對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.100μmol/L Res組；2.50μmol/LRes組；3.25μmol/L Res組；4.12.5μmol/L Res組Fig.3 Effects of Res on the expression of Bcl-2 mRNA in Bel-7402 cellsM：Standard of DNA molecular weight；1.100μmol/L Res group；2.50μmol/L Res group；3.25μmol/LRes group；4.12.5μmol/L Res group

2.3 Western Blot法檢測(cè)Res對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 由圖4 Western Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，肝癌Bel-7402細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明Res抑制了Bel-7402細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)。

圖4 Res對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Res on the expression of Bcl-2 protein in Bel-7402 cells

2.4 Res對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制 由表1可知，與對(duì)照組相比，Res能顯著抑制荷瘤小鼠移植性肝癌細(xì)胞Bel-7402的生長(zhǎng)，腫瘤重量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 Res對(duì)Bel-7402荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effects of Res on tumor growth ofmice with Bel-7402 tumor

2.5 ELISA法測(cè)定Res對(duì)荷瘤小鼠細(xì)胞因子的影響 由表2可知，與對(duì)照組相比，Res組荷瘤小鼠血清中的IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平明顯升高，有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 Res對(duì)Bel-7402荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響Tab.2 Effect of Res on cytokine levels ofmice with Bel-7402 tumor

3 討論

細(xì)胞凋亡能夠清除體內(nèi)老化變異的細(xì)胞，從而維持機(jī)體的穩(wěn)定。當(dāng)在基因水平上失去對(duì)某個(gè)細(xì)胞的正常調(diào)控時(shí)往往就會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。故而，細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有十分重要的意義。有研究顯示，白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化凋亡，但其具體的作用機(jī)制并不十分清楚。本研究通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，觀察白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖抑制作用，并對(duì)其抑癌的可能效應(yīng)機(jī)制進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外，白藜蘆醇對(duì)肝癌Bel-7402的增殖都顯示出了良好的抑制活性。此外還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇下調(diào)了Bel-7402細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)。Bcl-2是一種十分重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，位于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，它能夠抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［12-13］。所以，白藜蘆醇下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，可能就是其抑制Bel-7402細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的原因。

機(jī)體免疫調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂也是導(dǎo)致肝癌的重要因素，而導(dǎo)致免疫異常通常是由于血清細(xì)胞因子的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇治療組的荷瘤鼠血清中IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平升高。而IL-2是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中最重要的細(xì)胞因子，它能夠誘導(dǎo)免疫T細(xì)胞的增殖和促進(jìn)淋巴B細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。IL-6和IL-12也能夠誘導(dǎo)免疫T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞NK的產(chǎn)生［14-15］。大量的實(shí)驗(yàn)表明，IL-6和IL-12具有廣泛的抑瘤作用，甚至可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的消退［16-17］。此外，TNF-α作為一種腫瘤抑制因子，具有直接殺傷或抑制腫瘤的作用，也能夠促進(jìn)免疫T細(xì)胞和其他殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷力，可以作用于腫瘤血管，造成腫瘤血管的損傷，從而“餓死”腫瘤［18］。

總之，本研究證實(shí)白藜蘆醇能夠在體內(nèi)體外移植肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖。初步闡明了白藜蘆醇通過(guò)下調(diào)細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)，提高IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α的水平發(fā)揮抗腫瘤的作用。這對(duì)于開發(fā)白藜蘆醇衍生物類的抗癌藥物具有十分重要的意義。

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（編校：譚玲）

The inhibition and possiblemechanism of resveratrol on hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 both in vitro and vivo

ZHAO Dan-Yi1，DAIChao-xia1，CHEN Jun1，LIDan1Δ，Gao Wen-tao2

（1.Department of Oncology，The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China；2.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo explore the inhibition effect and the possiblemechanism of resveratrol on human hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 both in vitro and vivo.MethodsFour Res drugs in the experiment group，the final concentrations were 12.5，25，50，100μmol/L，the control group at the same time setnot containing Res drugs，MTT assaywas used tomeasure the inhibition of resveratrolon Bel-7402.The expression of Bcl-2 was detected by RT-PCR and Western Blot.The levels of IL-2，IL-6，IL-12 and TNF-αwere detected by ELISA.Results Resveratrol inhibited Bel-7402 cell proliferation in dose and timemanner，and influenced the expression of Bcl-2 mRNA and protein.At the same time，resveratrol inhibited the growth of tumor and improved the levels of IL-2，IL-6，IL-12 and TNF-α.Conclusion Resveratrol could inhibit Bel-7402 cell proliferation both in vitro and vivo，the possiblemechanism may be that resveratrol could low down the expression of Bcl-2 and improve the levels of IL-2，IL-6，IL-12 and TNF-α.

resveratrol；hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402；inhibition；mechanism

R735.7

A

1005-1678(2014）07-0006-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目計(jì)劃書（81172267）

趙丹懿，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤的介入治療，E-mail：qch1821460048@163.com；李丹，通信作者，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：惡性腫瘤多藥耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：qch1821460049@163.com。