CXCL12-CXCR4在胃癌中的表達(dá)及其與腹腔轉(zhuǎn)移的意義

峗淑莉 馮起校 劉振海

在胃癌中，腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移是比較常見(jiàn)的事件，也是晚期胃癌患者死亡的常見(jiàn)原因之一，胃癌患者合并腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，5年生存率只有2%，且對(duì)各種治療包括全身化療、腹腔內(nèi)化療效果很差。近年來(lái)的研究表明，趨化因子與其受體結(jié)合后通過(guò)激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及效應(yīng)分子參與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程。目前對(duì)于趨化因子及其受體研究較多的是CXCL12-CXCR4軸。本研究擬通過(guò)免疫組化的方法和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)觀察CXCR4的表達(dá)與胃癌腹腔轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

自2009年4月至2013年3月從本院外科手術(shù)切除的胃癌病例中選取63例免疫組化的胃癌組織標(biāo)本，其中腹腔轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移)29例，無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移34例。所有病例均由組織病理學(xué)檢查證實(shí)，術(shù)前均未接受放化療。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)中研究對(duì)象是胃癌SGC7901細(xì)胞。

1.2 材料與試劑

鼠抗人CXCR4單克隆抗體購(gòu)自Santan Cruz公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。Transwell小室模型購(gòu)自Corning公司。

1.3 免疫組化方法

①胃癌組織標(biāo)本給予10%甲醛處理，并常規(guī)石蠟包埋后制備4 μm厚連續(xù)切片。②切片脫脂后，經(jīng)0.3%過(guò)氧化氫-甲醇溶液浸泡30 min，以使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活。③將切片放入盛有0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 6.0)的高壓滅菌器內(nèi)加熱到120 ℃ 5 min。④室溫下將切片放入1%白蛋白的磷酸緩沖液(PBS)中孵育30 min，以減少非特異性著色。⑤在室溫下滴加CXCR4一抗孵育1 h。⑥室溫中將處理過(guò)的切片放入二抗標(biāo)記的過(guò)氧化物酶液中孵育15 min。⑦切片經(jīng)蘇木精著色。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Mattern等[1]的陽(yáng)性表達(dá)判斷的計(jì)數(shù)方法，CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞著色定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，采用盲法對(duì)所有切片進(jìn)行計(jì)數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞指的是染色后呈現(xiàn)棕黃色的細(xì)胞，或者是棕褐色的細(xì)胞。每張切片于腫瘤區(qū)域隨機(jī)取高倍視野100個(gè)(×400)，從每個(gè)視野中讀取200個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，算出每個(gè)視野的陽(yáng)性率，對(duì)所有視野的陽(yáng)性率計(jì)算平均值。

統(tǒng)計(jì)指標(biāo)：參照Iwasa等[2]研究中胃癌細(xì)胞中染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)，采用視覺(jué)評(píng)分等級(jí)，將CXCR4的表達(dá)劃分為4個(gè)等級(jí)。無(wú)CXCR4免疫染色的為等級(jí)0；CXCR4免疫染色數(shù)<10%的為等級(jí)1+；CXCR4免疫染色數(shù)≥10%～50%的為等級(jí)2+；CXCR4免疫染色數(shù)>50%的為等級(jí)3+。

1.5 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)方法

接種5×104/100 μl的胃癌SGC7901細(xì)胞至Transwell小室的上室，實(shí)驗(yàn)組在下室加27 μl含CXCL12趨化因子(1640培養(yǎng)基加0.5%BSA加100 ng/ml CXCL12)的液體誘導(dǎo)其遷移。對(duì)照組下室只加1640培養(yǎng)基(含0.5%BSA)，置于飽和濕度是37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)15 h，隨后取出小室，將上層細(xì)胞用棉簽擦去，常溫下在4%多聚甲醛中固定15 min。在PBS洗2次后風(fēng)干，再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，用純水洗3次，風(fēng)干。置于顯微鏡下觀察，各取5個(gè)200×視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞的數(shù)量，并且算出每個(gè)視野中平均穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包(SPSS，Chicago，IL)進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，免疫組化CXCR4表達(dá)陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)的比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性采用多元素分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4在有無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達(dá)情況

免疫組化顯示CXCR4在胃癌細(xì)胞的胞膜或胞質(zhì)中表達(dá)，在有腹腔轉(zhuǎn)移(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，腹膜轉(zhuǎn)移10例)的胃癌中，CXCR4的陽(yáng)性表達(dá)率為72.41% (21/29)，在無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，CXCR4的陽(yáng)性表達(dá)率為38.23%(13/34)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.359，P<0.05)。

2.2 CXCR4的表達(dá)與胃癌臨床病理的關(guān)系

CXCR4的表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度均無(wú)關(guān)，而與腹腔轉(zhuǎn)移的有無(wú)有顯著關(guān)系，見(jiàn)表1。

表1 CXCR4與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

2.3 CXCL12-CXCR4軸對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響

通過(guò)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在Transwell小室下室中加入趨化因子CXCL12，能促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901的遷移。實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(52.80±6.69)個(gè)細(xì)胞，對(duì)照組為(27.80±8.23)個(gè)細(xì)胞，P=0.001，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CXCL12-CXCR4軸對(duì)胃癌細(xì)胞遷移有重要的作用。

3 討論

本研究采用免疫組化的方法探討了CXCR4在有腹腔轉(zhuǎn)移及無(wú)腹腔轉(zhuǎn)移的胃癌手術(shù)切除標(biāo)本中的表達(dá)情況，并通過(guò)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CXCL12-CXCR4軸對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響。研究結(jié)果表明CXCR4的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的腹腔轉(zhuǎn)移是有密切關(guān)系的，CXCL12-CXCR4軸可作為評(píng)估胃癌腹腔轉(zhuǎn)移的1個(gè)觀測(cè)指標(biāo)。

趨化因子不僅對(duì)淋巴細(xì)胞歸巢和免疫功能的保持起到非常重要的作用，而且也影響到血管再生、膠原蛋白的合成、骨髓細(xì)胞的生成。已有研究證明，趨化因子系統(tǒng)是上皮腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制之一，能夠調(diào)節(jié)白細(xì)胞轉(zhuǎn)移和歸巢。腫瘤細(xì)胞的趨化因子受體表達(dá)在腫瘤生物學(xué)中起到至關(guān)重要的作用，尤其是，CXCR4的表達(dá)與不同腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的表現(xiàn)之間的關(guān)系更為密切[3]。在正常組織中CXCR4廣泛表達(dá)，對(duì)胎兒生長(zhǎng)、造血干細(xì)胞的運(yùn)作以及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移起著基礎(chǔ)性的作用[4]。

CXCL12-CXCR4軸在胃癌的演進(jìn)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。Ishigami等[5]通過(guò)免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，在185例胃癌患者的胃癌組織學(xué)標(biāo)本中，有74例CXCL12陽(yáng)性表達(dá)，且其陽(yáng)性表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、淋巴管浸潤(rùn)、腫瘤最大直徑及臨床分期有關(guān)。Lee等[6]對(duì)5種胃癌細(xì)胞系采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)( RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡、流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡方法研究CXCR4的表達(dá)情況，探討221例胃癌患者中CXCR4表達(dá)和臨床特征之間的關(guān)系。結(jié)果表明，CXCR4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，并且與存活率的減少也相關(guān)，CXCR4的表達(dá)與胃癌細(xì)胞體內(nèi)移行有關(guān)，在胃癌惡化中起到重要的作用。徐斌等[7]采用S-P 免疫組化法及RT-PCR探討胃癌組織中CXCR4 和MMP-9 的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌CXCR4和MMP-9 的表達(dá)之間存在一定相關(guān)性，兩者的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究也證實(shí)了胃癌腹腔轉(zhuǎn)移與CXCL12的受體CXCR4在胃癌中的表達(dá)相關(guān)，與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，可能與本研究標(biāo)本例數(shù)較少有關(guān)。Yasumoto等[8]認(rèn)為趨化因子與胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移的發(fā)展有關(guān)系，在檢驗(yàn)臨床患者中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自有腹膜癌病者的惡性腹腔積液中含有高濃度的CXCL12 (4.67 ng/mL)，免疫組織化學(xué)分析表明，2/3的有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌中CXCR4表達(dá)，然而有1/4的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胃癌的CXCR4的表達(dá)陽(yáng)性。CXCR4表達(dá)的原發(fā)腫瘤中85%會(huì)發(fā)展成腹膜轉(zhuǎn)移。原發(fā)性胃癌的CXCR4表達(dá)與腹膜種植轉(zhuǎn)移的發(fā)展顯著相關(guān)。CXCR4/CXC12軸在胃癌的腹膜種植轉(zhuǎn)移的發(fā)展中起重要的作用。這與本研究結(jié)果相一致。他們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在裸鼠體內(nèi)注入人的胃癌細(xì)胞系會(huì)形成大量的惡性腹腔積液，并有選擇地表達(dá)CXCR4 mRNA，尤其是，NUGC4細(xì)胞表達(dá)出高濃度的CXCR4 mRNA，快速增強(qiáng)了蛋白激酶B/Akt的磷酸化作用，在裸鼠體內(nèi)AMD3100(一種特殊的CXCR4拮抗劑)能夠有效地減緩腫瘤生長(zhǎng)和惡性腹腔積液的形成。

本研究也用Transwell小室模型體外證實(shí)了CXCL12-CXCR4軸能促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901的遷移。關(guān)于CXCL12-CXCR4軸影響胃癌腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，目前只有少數(shù)的報(bào)道，Hashimoto等[9]發(fā)現(xiàn)CXCL12促進(jìn)胃癌的腹腔內(nèi)播散是通過(guò)激活mTOR通路，升高基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力。CXCL12-CXCR4軸影響胃癌腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移的機(jī)制的深入研究，將為治療胃癌合并腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點(diǎn)，并為進(jìn)一步治療和預(yù)防胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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