重組人血管內(nèi)皮抑素對肺腺癌放射增敏作用的動物實(shí)驗(yàn)研究

張蓓蓓 高春玲 程小峰 王笑良 陳玉強(qiáng) 吳曉安 章志勇

肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，而且其發(fā)病率逐年上升，其中非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生率占肺部腫瘤的80%以上[1]。在臨床上肺癌的治療主要依賴手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療四大手段，早期以手術(shù)為主，中晚期通常采用綜合治療的手段，我國70%左右的患者在確診時已處于晚期[2]，無法進(jìn)行手術(shù)治療，主要采用放化療結(jié)合的綜合治療。而放療在治療局部中晚期非小細(xì)胞肺癌中起到重要作用，所以提高腫瘤細(xì)胞對放射治療的敏感性，必將提高非小細(xì)胞肺癌的治愈率。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑素能夠增強(qiáng)放射線對腫瘤的殺滅效應(yīng)[3]。本文主要探討重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合放療對肺腺癌的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及細(xì)胞系

本實(shí)驗(yàn)動物為裸鼠，裸鼠的喂養(yǎng)和使用都根據(jù)廈門大學(xué)的指南和規(guī)范。細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用加入10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞每周常規(guī)傳代2次。置于5% CO2和 37°C飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞系為人肺腺癌細(xì)胞系973。

1.2 藥物及給藥方法

重組人血管內(nèi)皮抑素為無色透明液體，規(guī)格5 mg/ml，用藥濃度為2 mg/kg，采用生理鹽水稀釋。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組方法和每只裸鼠的體重計算給藥的劑量，然后腹腔注射已經(jīng)稀釋好的藥液，對照組注射同等體積的生理鹽水。腫瘤最大徑增長至0.5 cm時開始用藥，每天1次，連續(xù)用藥14天。

1.3 腫瘤模型的建立和分組

將973細(xì)胞置于DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞呈指數(shù)分裂狀態(tài)時，消化后制成107/L細(xì)胞密度的懸液。每只鼠右下肢大腿皮下注入0.3 ml細(xì)胞懸液形成腫瘤模型。荷瘤鼠隨機(jī)分成4組：空白對照組，單照組，聯(lián)合治療組，單藥組，每組各8只裸鼠。

1.4 照射方法及照射條件

用6MV直線加速器(瓦里安公司，美國)放療。將荷瘤裸鼠裝入一自制的有機(jī)玻璃盒內(nèi)，并將其用橡皮圈固定在一塑料板上。腫瘤暴露在正中，裸鼠其他部分采用鉛塊遮擋，腫瘤表面加蓋1.5 cm有機(jī)玻璃板作為組織補(bǔ)償，于重組人血管內(nèi)皮抑素用藥第1天進(jìn)行單次照射，照射劑量為15 Gy。

1.5 評價方法

分組后，觀察荷瘤裸鼠的一般情況，實(shí)驗(yàn)中采用盲法每2日由專人用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的最長徑(A)、垂直徑(B)以及瘤的高度(C)，并按公式V=π/6·A·B·C計算腫瘤體積。當(dāng)各組腫瘤的體積增長至用藥時的腫瘤體積兩倍時為實(shí)驗(yàn)終止點(diǎn)。 腫瘤生長延緩時間：絕對腫瘤生長延緩時間(AGD，absolute growth delay)=TR-TC(TR 為單純照射組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù)，TC為對照組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù))。規(guī)格化腫瘤生長延緩時間(NGD，normalized growth delay)=TL-TG(TL為聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù)，TG為單純藥物組小鼠腫瘤體積增長2倍的天數(shù))；增敏系數(shù)(EF)=NGD/AGD。 EF>1 提示有放射增敏效應(yīng)。

1.6 評價指標(biāo)

如果增敏系數(shù)EF>1，提示有放射增敏效應(yīng)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用origin軟件繪制腫瘤生長曲線，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計方法采用Mann-Whitney u檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；P<0.01為差異高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤鼠的一般情況

分組后，觀察荷瘤裸鼠的一般情況：空白對照組進(jìn)食及活動狀況良好，6只右下肢荷瘤部位皮膚潰爛；單藥組進(jìn)食及活動狀況良好，2只腫瘤表面皮膚潰爛；單照組和聯(lián)合治療組荷瘤裸鼠的進(jìn)食略減少，2只腫瘤表面皮膚潰爛。

2.2 腫瘤生長曲線

根據(jù)各組小鼠腫瘤的體積繪制腫瘤生長曲線。空白對照組、單藥組腫瘤生長情況相似；15 Gy單照組從第8天開始，腫瘤生長較空白組受到不同程度抑制(P<0.01)，聯(lián)合治療組腫瘤生長較空白組生長抑制明顯(P<0.01)，各組腫瘤生長曲線見圖1。

圖1 各組荷瘤裸鼠的腫瘤生長抑制曲線

2.3 腫瘤生長延遲和增敏系數(shù)

空白對照組腫瘤體積增長至2倍時的天數(shù)為5天，單藥組腫瘤體積增長至用藥時的腫瘤體積2倍時的天數(shù)為12天，單照組腫瘤體積增長至放射前2倍時的天數(shù)為12天，聯(lián)合治療組腫瘤體積增長至用藥時腫瘤體積2倍時的天數(shù)為25天。增敏系數(shù)為1.9。腫瘤體積2倍倍增時間和腫瘤生長延遲時間應(yīng)用Origin軟件計算，見表1。

表1 各組腫瘤生長延緩時間及重組人血管內(nèi)皮抑素的增敏系數(shù)

3 討論

放射治療是治療腫瘤的1種重要手段，在惡性腫瘤患者的治療中50%以上接受放射治療[4]，但是，單獨(dú)接受放射治療治愈率往往不高，因?yàn)槟[瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種因素、多種途徑以及多種基因變化共同作用的過程，需要放射聯(lián)合具有協(xié)同或增敏作用的其他藥物從多個角度來殺傷腫瘤細(xì)胞。血管的生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到舉足輕重的作用，因此抗腫瘤血管生成的治療方法就成為了目前研究的熱點(diǎn)。

重組人血管內(nèi)皮抑素是1種血管生成抑制劑，是由O'Reilly等[5]首次從鼠血管內(nèi)皮瘤的細(xì)胞系培養(yǎng)基中提取出來的。它能夠通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、抑制血管內(nèi)皮生長因子、抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移從而抑制腫瘤血管的生成[6]，進(jìn)而抑制腫瘤的生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移來發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，重組人血管內(nèi)皮抑素可以使腫瘤血管出現(xiàn)短暫的“正?；盵7-8]，在這個短暫的時間窗內(nèi)腫瘤可以重新獲得正常的氧供，從而提高了放射線的殺傷效率。重組人血管內(nèi)皮抑素還具有副作用小[9]、不易產(chǎn)生耐藥性及不易復(fù)發(fā)等優(yōu)點(diǎn)[10]。

在本實(shí)驗(yàn)中，以人肺腺癌973細(xì)胞系為研究對象，建立移植瘤模型，通過不同的處理方式作用于荷瘤裸鼠，觀察重組人血管內(nèi)皮抑素的作用效果。從腫瘤的生長曲線來看，相較于空白對照組，單藥組、單純放療組、聯(lián)合治療組腫瘤的生長都不同程度的受到抑制，但是聯(lián)合治療組抑瘤效果較其他組更加明顯。通過計算各實(shí)驗(yàn)組的倍增時間，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組腫瘤體積增長至用藥時的腫瘤體積2倍時的天數(shù)為25天，明顯長于其他實(shí)驗(yàn)組。計算增敏系數(shù)EF為1.9>1，我們就可以認(rèn)為，重組人血管內(nèi)皮抑素對放療有輕微的增敏效應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，重組人血管內(nèi)皮抑素能夠顯著抑制腫瘤的生長，可能對肺腺癌的放射治療具有增敏效應(yīng)，對提高肺腺癌的放療效果具有良好的應(yīng)用前景。

但是，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，在我們的實(shí)驗(yàn)中重組人血管內(nèi)皮抑素具有輕微的放射增敏效應(yīng)，分析原因可能為照射時間為用藥第1天，腫瘤內(nèi)血管尚未處于血管正?；臅r間窗。我們將就此方面做進(jìn)一步研究。另外，重組人血管內(nèi)皮抑素確切作用機(jī)制及放射增敏作用機(jī)制尚未明確闡述，我們也將就重組人血管內(nèi)皮抑素放射增敏作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

[1] Pignon J Tribodet H，Scaglioti GV，et al.Lung adjuvant cisplatin evaluation：a pooled analysis by the LACE Collaborative Group〔J〕.J Clin Oncol，2008，26(21)：3552-3559.

[2] Azim HA Jr，Elatar I，Loberiza FR Jr，et al.Third generation triplet cytotoxic chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer：a systematic overview〔J〕.Lung Cancer，2009，64(2)：194-198.

[3] Ziche M，Donnini S，Morbidelli L.Development of new dru-gs in angingenesis〔J〕.Curr Drug Targets，2004，5(5)：485-493.

[4] Ringborg U，Bergqvist D，Brorsson B，et al．The Swedish C-ouncil on Technology Assessment in Health Care(SBU)systematic overview of radiotherapy for cancer including a prospective survey of radiotherapy practice in Sweden 2001一summary and conclusions〔J〕．Acta Oncol,2003，42(5-6)：357-365.

[5] O'Reilly MS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatin：an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth〔J〕.Cell，1997，88(2)：277-285.

[6] Dong GY，YE B，YU XH，et al.Clinical observation of recombinant human endostatin combined stereotactic radiotherapy in advanced malignant tumors〔J〕.Chin Clin Oncol，2009，14(11)：1035-1037.

[7] Fukumura D，Jain RK.Tumor microvasculature and microenvironment：targets for anti-angiogenesis and normalization〔J〕.Microvasc Res，2007，74(2-3)：72-84.

[8] Huang G，Chen L B.Recombinant human endostatin improves antitumor efficacy of paclitaxel by normalizing tumor vasculature in Lewis lung carcinoma〔J〕.J Cancer Ras Clin Oncol，2010，136(8)：1201-1211.

[9] 章 駿，趙 怡，楊志剛，等.恩度聯(lián)合化療治療多種惡性復(fù)發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移灶的療效觀察〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2011，26(1)：69-70.

[10] Feldman AL，Restifo NP，Alexabder HR，et a1.Antiangiogenic gene therapy of cancer utilizing a recombinant adenovirus to elevate systemic endostatin levels in mice〔J〕.Cancer Res，2000，60(6)：1503-1506.