H2S氣體分子及相關藥物研究進展*

楊 雪，劉 潔，吳曉明，徐進宜

中國藥科大學藥學院藥物化學教研室，南京 210009

隨著生命科學的迅猛發(fā)展，氣體小分子在生命活動中的意義受到越來越多的關注。伴隨著氣體信號分子NO和CO的發(fā)現(xiàn)，Wang等[1]在2002年又發(fā)現(xiàn)了第三種新型氣體信號分子，即H2S氣體信號分子。研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度下的H2S分子參與體內多個生理環(huán)節(jié)的調節(jié)，尤其在高血壓、肺動脈高壓、帕金森、阿爾茲海默等疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。

1 內源性H2S的合成與代謝

1.1 H2S的體內合成過程

H2S是一種無色，易燃，具有臭雞蛋氣味的氣體分子。在哺乳動物組織內，它的內源性合成以L-半胱氨酸為底物，主要依賴于兩種5’-磷酸吡哆醛依賴性酶，胱硫醚-β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γlyase，CSE）[2]。這兩種酶的分布具有組織特異性:CBS主要催化腦組織以及神經組織內H2S的生成，并在肝臟和腎臟中高度表達；CSE主要在肝臟以及血管/非血管平滑肌中高度表達，并且在嚙齒類動物的小腸以及胃中也檢測到低濃度的CSE[2-3]。同時發(fā)現(xiàn)，在線粒體中，巰基丙酮酸硫轉移酶（3-mercaptopycurate sulfurtransferase，3MST）也可以催化半胱氨酸生成 H2S[4]（見圖 1）。Shibuya等[5]在 2012 年發(fā)現(xiàn)在小腦和腎臟中，D-半胱氨酸可以在氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAO）和巰基丙酮酸硫轉移 酶（3-mercaptopyruvate sulphur transferase，3-MST）的作用下生成H2S。

1.2 體內H2S的代謝過程

體內生成的H2S有1/3以氣體形式存在，另外2/3則以NaHS的形式存在，并且兩者處于一種動態(tài)平衡。H2S在體內的主要代謝途徑是經氧化代謝形成硫酸鹽。在代謝過程中體內的硫化物先轉化為硫代硫酸鹽，再經硫代硫酸鹽還原酶或硫代硫酸鹽硫基轉移酶的作用下轉化為亞硫酸鹽，亞硫酸鹽在谷胱甘肽的參與下氧化為硫酸鹽，從腎臟排出。另外少部分硫化物則代謝為蛋白加合物，經甲基化代謝而形成毒性較低的甲硫醇和甲硫醚[6]（見圖1）。

2 外源性H2S供體類型

如圖2所示，外源性的H2S供體主要包括7種類型:（1）Na2S、NaHS、CaS 等含硫化鹽[7-8]；（2）勞森試劑（二硫代磷酸酯類）衍生物（如 GYY4137）[9]；（3）天然產物中大蒜素類（如二烯丙基三硫化物（DATS））[10]；（4）二硫代硫酮類衍生物（如去甲茴三硫）[11]；（5）N-（苯甲?；?硫代苯甲酰胺類衍生物[12]；（6）S-乙?；^硫類化合物[13]；（7）硫代氨基酸類化合物[14]。

3 H2S的主要生理活性

3.1 血管擴張活性

圖1 哺乳動物細胞中H2S生成與代謝過程

圖2 7種外源性H2S供體類型

原發(fā)性高血壓患者中存在同型半胱氨酸和H2S的代謝不平衡，經治療的高血壓患者組的血漿H2S濃度明顯低于正常對照組。在經治療的高血壓患者中，隨著血壓水平的增加，H2S水平均逐漸降低，三級高血壓水平患者的H2S濃度均明顯低于血壓控制良好者，該研究結果表明H2S在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中均具有重要作用[15]。

敲除小鼠的CSE基因會導致血漿、心臟、主動脈條等組織內H2S濃度的顯著下降，進而引起小鼠內皮依賴的擴血管活性下降，血壓出現(xiàn)明顯上升[4]。Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)H2S通過開放血管平滑肌細胞ATP敏感的鉀通道（KATP）使收縮的血管呈濃度依賴性舒張。當靜脈推注H2S會使大鼠血壓出現(xiàn)12～30 mmHg的短暫下降，該降血壓活性類似吡那地爾（KATP開放劑），并可被格列本脲（KATP阻滯劑）拮抗。為進一步確定H2S對KATP通道的作用，研究者采用全細胞膜片鉗技術將單個細胞以300 μm的H2S孵育后，檢測發(fā)現(xiàn)KATP通道電位峰值和時程寬度顯著增大。KATP通道對細胞總電流的增加會直接引起細胞膜的超極化，進而松弛血管平滑肌。其后對一組細胞進行同樣監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)H2S能夠增加電壓依賴性鉀通道總電流。當洗去H2S后，KATP通道興奮性消失。以上研究表明，與NO及CO通過激活cGMP通路產生擴血管活性不同，H2S舒張血管平滑肌的功能是通過開放血管平滑肌細胞的KATP通道來實現(xiàn)的。

2008年，Yang等[3]標記小鼠的CSE基因，以野生型小鼠（基因型CSE＋／＋）為對照組，選擇突變的純合子鼠（基因型 CSE－／－）和雜合子鼠（基因型 CSE－／＋）作為研究對象。與野生型鼠相比，用苯腎上腺素收縮腸系膜動脈條后，乙酰甲膽堿對突變型鼠腸系膜動脈的舒張作用顯著下降。對于剝除內皮的野生型小鼠和突變小鼠，乙酰甲膽堿的血管舒張活性均基本消失。因此確證，H2S擴血管作用機制還依賴于內皮衍生化松弛因子（Endothelium Derived Relaxing Factor，EDFR）[3]。乙酰甲膽堿對內皮細胞的刺激會導致1，4，5-三磷酸肌醇的大量生成，進而與肌漿網上的1，4，5-三磷酸肌醇受體結合，激活細胞內Ca2+釋放通道，增加細胞內Ca2+的濃度。受到Ca2+激活的鈣調蛋白，通過形成活化的Ca2+-鈣調蛋白復合物，再與CSE結合從而增加酶活力，催化內源性H2S的生成。

Mustafa等[17]的進一步研究表明，H2S對內皮松弛作用也可歸因于超極化作用，即內皮衍生超極化因 子（endothelium-derived hyperpolarizing factor，EDHF）的效果。生物體內源性H2S分子正是通過激活血管內皮和平滑肌細胞中ATP敏感的中電導以及小電導鉀通道來產生超極化和擴血管效應（見圖3）。這也闡明了H2S開放KATP通道的作用機制。

圖3 H2S的血管擴張活性機制[16]

3.2 抑制血管平滑肌的增殖

Du等[18]發(fā)現(xiàn)內源性H2S可以通過下調絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase，MAPKs）的活性，進而劑量依賴地抑制大鼠動脈血管平滑肌細胞的增殖。其后，Yang等[19]探究了CSEH2S系統(tǒng)對CSE過度表達的HEK-293細胞增殖的抑制作用，結果顯示，CSE的過度表達會激活細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的級聯(lián)反應，并增強上游p21Cip/WAK-1基因的表達，從而抑制平滑肌細胞增殖。此外，近年來研究表明，內源性CSE-H2S通路參與體內多種心血管疾病（自發(fā)性高血壓[20]、N-硝基-L-精氨酸甲酯誘導的高血壓[21]、低氧肺動脈高壓[22]以及敗血性和內毒素休克[23]）的發(fā)病與轉歸。因此，研究和開發(fā)能改善CSE生理活性或者調節(jié)H2S所介導通路的藥物，對心血管疾?。ㄓ绕涫歉哐獕海┑闹委熅哂袠O其重要的借鑒意義。

3.3 神經調節(jié)作用

生理濃度下的H2S可以激活腺苷酸環(huán)化酶（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和蛋白激酶 A（proteinkinase A，PKA）的級聯(lián)反應，從而增強N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA）介導的反應，并誘導海馬體的長時程增強（long-term potentiation，LTP）[24]。此外，研究者們發(fā)現(xiàn)，H2S通過L型/T型鈣離子通道和細胞膜上的NMDA受體作用來增加神經元細胞、星形膠質細胞以及小神經細胞內Ca2+的動態(tài)平衡[25]。最后，在原代培養(yǎng)大鼠星形膠質細胞和小膠質細胞中，研究者們發(fā)現(xiàn)H2S可以通過調控Cl-/HCO3-交換和Na+/H+交換來調節(jié)細胞內pH水平[26]。因此，H2S通過調節(jié)神經細胞Ca2+的動態(tài)平衡和細胞內pH穩(wěn)態(tài)，從而介導神經元細胞和星形膠質細胞之間的信號傳遞，調節(jié)突觸活動，發(fā)揮神經調節(jié)作用。

3.4 抗炎作用

白細胞粘附作用是炎癥反應的第一步，與免疫反應、血管損傷、動脈粥樣硬化及血栓形成等過程有密切關系。研究發(fā)現(xiàn)，H2S供體不僅可以劑量依賴性地抑制由阿司匹林引起的白細胞粘附，而且也可以抑制阿司匹林引起的的白細胞以及內皮細胞上粘附因子表達[27]。此外，還發(fā)現(xiàn)H2S供體對炎癥部位的白細胞浸潤以及角叉菜膠誘導大鼠足腫模型都有明顯的抑制作用[28]。

H2S介導的抗炎機制對神經細胞也具有保護作用。2007年，Hu等[29]發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的神經膠質細胞、星形膠質細胞以及永生化小鼠的BV2膠質細胞中，NaHS可以抑制脂多糖誘導的NO等炎癥因子生成和釋放、減少腫瘤壞死因子α的分泌。其后，Lee等[30]也證實H2S供體型化合物在神經炎癥中對神經元具有保護作用，例如去甲茴三硫、S-雙氯芬酸鈉、S-阿司匹林（見圖4）。研究發(fā)現(xiàn)，H2S可能通過抑制炎癥因子的生成并促進抗炎細胞因子的生成來減輕神經元細胞炎癥反應。當給予小膠質細胞和神經膠質細胞適當刺激后，這兩種神經膠質細胞會產生致炎因子，從而導致神經炎癥反應的發(fā)生。H2S可以上調如白介素-4/10等抗炎因子，并抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β以及NO等炎癥因子的產生，從而保護神經細胞免受炎癥因子的進攻（見圖 5）。

圖4 H2S供體型化合物

圖5 H2S對小膠質細胞和星形膠質細胞抗炎機制[30]

4 內源性H2S分子的檢測手段

隨著化學、生物學和材料科學的交叉越來越深入，利用熒光手段研究有機小分子在生物體中的作用機制成為研究熱點。其中用于檢測H2S釋放和定位的小分子熒光探針更是飛速發(fā)展。這些小分子熒光探針主要包括利用H2S還原反應的疊氮類熒光探針[31]，基于邁克爾加成反應的熒光探針[32]，離子絡合類熒光探針[33]以及近紅外比率型熒光探針[34]。其中，近紅外感受器具有低背景干擾以及高細胞穿透力的特點，使其對H2S在低穩(wěn)態(tài)濃度下的定量檢測更為準確。因此，研究者們可以嘗試利用近紅外的熒光性質來設計靈敏度更高、響應時間更短的探針，從而簡化對細胞內H2S釋放的檢測。

圖6 H2S供體型化合物

5 H2S供體型藥物的發(fā)展

從天然植物中提取含硫化合物曾受到研究者廣泛關注。例如大蒜提取物中的二烯丙基多硫化物可在紅細胞中通過硫醇依賴性的方式生成硫化氫,這也是大蒜實現(xiàn)降血壓、保護心血管的主要機制。

隨著H2S在生物體內釋放指征的明確，研究者們可以設計更多H2S釋放的供體靶向藥物。目前，在現(xiàn)有藥物基礎上進行基團改造使之釋放H2S，也是當代藥物研發(fā)的一個分支。例如，因為H2S供體可以抑制磷酸酯酶，參與勃起功能障礙的調節(jié)，專門研發(fā)硫化氫供體類型藥物的CTG-Pharma公司將H2S供體的化合物與西地那非拼合，合成了西地那非-茴三硫，用于松弛陰莖海綿體平滑肌，其對磷酸酯酶的抑制強于西地那非[35]（見圖6-1）。

為了減弱非甾體抗炎藥（Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs）對胃腸道、肝、腎以及血液系統(tǒng)等不良反應，研究者常常將H2S供體基團和NSAIDs拼合，從而形成新的化學實體。如Antibe Therapeutics公司將H2S供體（4-羥基硫代苯甲酰胺）和萘普生拼合得到ATB-346（見圖6-2），以期待用于改善骨關節(jié)炎的治療。與萘普生相比，ATB-346不僅可以更有效地抑制COX-2的活性，還可以減少對胃腸道的損傷，加速已有胃潰瘍病灶的愈合[36]，目前ATB-346已處于臨床前有效性和毒理測試階段。拼合去甲茴三硫的雙氯芬酸鈉衍生物ATB-337（見圖6-4），不僅白細胞粘附作用下降，抗炎活性增強，而且胃腸道副作用減小，降低藥物副作用[11]。此外，Antibe Therapeutics公司將美沙拉嗪和去甲茴三硫拼合的化合物ATB-429，針對伴隨炎癥性腸胃病的內臟痛，其鎮(zhèn)痛效果顯著[37]（見圖6-3）。

值得一提的是，Kodela等[38]將NO供體和H2S供體同時和阿司匹林拼合，形成NO和H2S雙供體型阿司匹林化合物NOSH-1（見圖6-5）。在角叉菜膠大鼠足腫脹模型中，NOSH-1抗炎活性和阿司匹林相當。而在抗腫瘤活性篩選實驗中，NOSH-1對HT-29結腸癌細胞的IC50為48±3 nm，其抑制作用遠遠高于阿司匹林。NOSH-1以4倍IC50濃度孵育細胞24小時，其乳酸脫氫酶釋放小于10%，證明了NOSH-1是選擇性殺死腫瘤細胞的活性化合物。對大腸癌異種移植的大鼠連續(xù)給藥6天后，其腫瘤體積明顯縮小。Chattopadhyay等[39]確證NOSH-1能夠通過誘導細胞凋亡及細胞G0/G1周期停滯來抑制腫瘤細胞增殖，這也為硫化氫供體型化合物的研發(fā)拓展了新的領域。

6 展 望

綜上所述，H2S對人體各個系統(tǒng)的調節(jié)作用不可小覷。作為一種新型的氣體信號分子，其在擴張血管平滑肌、抑制平滑肌增殖、神經保護以及抗炎中均發(fā)揮了重要的作用。在此基礎上，拼合硫化氫供體型藥物的問世也引起當代新藥研發(fā)的關注。然而，由于對H2S釋放指征的缺乏，H2S從生理組織產生到作用部位的釋放過程還有待闡明，其在病理條件下的生物學功能以及信號轉導通路也有待進一步的探究。隨著越來越多檢測手段的發(fā)展，研究者們對H2S在人體生理系統(tǒng)內的調控將越來越明確，這必將進一步促進H2S及其供體型藥物在臨床的應用。

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