重組chemerin蛋白對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞visfatin、MCP-1基因表達(dá)的影響

焦 誼 常 曦 王麗鳳 李俊紅 關(guān)亞群

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

近幾年的研究表明，脂肪源性細(xì)胞因子參與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗(IR)、2 型糖尿病(T2DM)等病理生理過程。脂肪細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子如chemerin、內(nèi)脂素(visfatin)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等均參與機(jī)體一些重要機(jī)能的調(diào)節(jié)〔1～3〕。脂肪細(xì)胞不僅參與能量代謝，還參與了炎癥反應(yīng)，MCP-1 是單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的主要趨化因子。有研究顯示MCP-1 與各種肥胖相關(guān)性疾病存在明顯相關(guān)，因此，MCP-1 可能成為肥胖相關(guān)性疾病十分有用的治療靶點(diǎn)〔4，5〕。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，chemerin表達(dá)水平隨著脂肪細(xì)胞分化成熟而顯著上調(diào)〔6〕,但其如何影響糖、脂代謝以及參與肥胖誘導(dǎo)的IR的確切機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究采用不同時(shí)間、劑量的chemerin蛋白干預(yù)成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，觀察該蛋白對(duì)MCP-1、visfatin基因表達(dá)的影響，為深入研究chemerin蛋白在肥胖、糖尿病等疾病發(fā)病中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素購(gòu)自Gibico公司，胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine IBMX)、地塞米松購(gòu)自Sigma公司，重組小鼠chemerin蛋白購(gòu)自R&D公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司， PCR擴(kuò)增試劑盒等購(gòu)自上海生工生物有限公司。

1.2方法

1.2.1脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，用含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細(xì)胞接觸抑制2 d后開始誘導(dǎo)分化(第0天)，加入含有0.5 mmol/L IBMX、2.5 μmol/L地塞米松、5 μg/ml胰島素、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液誘導(dǎo)48 h后；換用含5 μg/ml胰島素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)48 h，隨后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化至第10天；90%以上的3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，油紅O染色鑒定后既可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2chemerin蛋白干預(yù)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞 將誘導(dǎo)分化成熟后的3T3-L1脂肪細(xì)胞，采用隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為 15組，予以含0.2% BSA的DMEM培養(yǎng)液饑餓過夜后，分別以不同濃度梯度(0、25、50、100、200 ng/ml)的chemerin蛋白作用12、24、48 h，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，分別收集不同濃度chemerin干預(yù)后的脂肪細(xì)胞，置-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.33T3-L1脂肪細(xì)胞總RNA提取及RT-PCR檢測(cè)visfatin、MCP-1基因mRNA的表達(dá) 按照Invitrogen公司Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA,用Gene Quant Pro紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度,確保A260/A280>1.8，1%瓊脂糖凝膠鑒定RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄方法參照Promega試劑盒說明書進(jìn)行操作，取總RNA 1 μg,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。根據(jù)Genebank中小鼠β-actin、visfatin和chemerin cDNA序列,應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列及擴(kuò)增退火溫度及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1。

表1 小鼠β-actin、visfatin、MCP-1引物信息

以6 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，進(jìn)行visfatin、MCP-1及β-actin基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μl。MCP1與β-actin的擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，總延伸72℃ 7 min。visfatin的擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，總延伸72℃ 7 min。目的基因表達(dá)量的檢測(cè)：取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl置于含溴化乙錠的2.0%瓊脂糖凝膠中電泳；利用Bio-Rad凝膠成像儀成像，用β-actin的吸光度值作為內(nèi)參照,計(jì)算visfatin、MCP-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量而進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.13T3-L1脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 誘導(dǎo)分化前,3T3-L1前體脂肪細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞質(zhì)中不含脂滴。誘導(dǎo)后第2～4天細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,細(xì)胞體積增大,逐漸由梭形變?yōu)閳A形,可見少數(shù)細(xì)胞的胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)亮紅的小脂滴。誘導(dǎo)第8～10天的細(xì)胞約90%多呈脂肪細(xì)胞表型，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中含多個(gè)脂滴。見圖1。

圖1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化的不同時(shí)段油紅O染色結(jié)果(×200)

2.2chemerin蛋白對(duì)誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞visfatin基因表達(dá)的影響 使用不同劑量的chemerin蛋白作用于分化成熟后3T3-L1脂肪細(xì)胞，結(jié)果顯示：作用24 h后，100 ng/ml的 chemerin蛋白干預(yù)組與未干預(yù)組比較，visfatin的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；作用48 h后；50、100、200 ng/ml的chemerin蛋白干預(yù)的細(xì)胞與未干預(yù)組比較，visfatin的表達(dá)升高(P<0.05)，且表達(dá)量隨著chemerin濃度的增加而增加，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 不同劑量chemerin蛋白干預(yù)不同時(shí)間對(duì)visfatinmRNA表達(dá)的影響

1～5泳道:chemerin200、100、50、25、0 ng/ml；M：DNA Marker

圖2chemerin蛋白干預(yù)48hvisfatin電泳圖

2.3chemerin蛋白對(duì)誘導(dǎo)分化成熟的3T3-Ll脂肪細(xì)胞MCP-1基因表達(dá)的影響 使用不同劑量的chemerin蛋白作用于分化成熟后3T3-Ll脂肪細(xì)胞，結(jié)果顯示： 25、100、200 ng/ml的chemerin蛋白干預(yù)12 h后，MCP-1的表達(dá)chemerin干預(yù)組與未干預(yù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；作用24和48 h后，50、100、200 ng/ml的chemerin蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)MCP-1的表達(dá)與未干預(yù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、 圖3。

1～5泳道分別表示chemerin干預(yù)劑量為200、100、50、25、0 ng/ml時(shí)，24 h后MCP-1和β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；6～10泳道分別表示chemerin干預(yù)劑量為200、100、50、25、0 ng/ml時(shí)，48 h后MCP-1和β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；M：DNA Marker

圖3chemerin蛋白干預(yù)24和48h后MCP-1電泳圖

表3 不同劑量chemerin蛋白對(duì)干預(yù)不同時(shí)間MCP-1基因mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

Chemerin是Bozaoglu等〔7〕采用新的信號(hào)序列捕獲技術(shù)確定的、主要表達(dá)于成熟的脂肪細(xì)胞、并由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。chemerin作為抗原呈遞細(xì)胞特異性亞群的趨化因子，在炎癥或組織損傷部位具有潛在的控制免疫應(yīng)答的作用，然而其在代謝調(diào)節(jié)中的作用并不清楚。本課題組前期研究結(jié)果顯示，chemerin和visfatin表達(dá)趨勢(shì)與脂質(zhì)積聚過程呈現(xiàn)較好的一致性，提示兩者與脂肪細(xì)胞成熟及脂質(zhì)積聚有關(guān)，但是具體的作用機(jī)制目前還不清楚。

本研究表明chemerin的干預(yù)促進(jìn)了visfatin的表達(dá)，并且具有明顯的時(shí)間與劑量依賴性。有研究顯示在脂肪細(xì)胞成熟階段沉默chemerin基因，將使涉及葡萄糖代謝和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的基因表達(dá)降低；外源性給予濃度為100 ng/ml的重組人chemerin可以促進(jìn)3T3-Ll前脂肪細(xì)胞在胰島素干預(yù)下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加41%。若用重組的鼠chemerin也可以得到類似的結(jié)果〔8〕。由于visfatin具有模擬胰島素的作用，因此chernerin也可能通過促進(jìn)visfatin的表達(dá)來(lái)增加胰島素的敏感性。

chemerin刺激了樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化性〔9〕，由于這些細(xì)胞表達(dá)chemerin受體，因此chemerin有可能在這些細(xì)胞向炎癥部位的募集中起作用。脂肪因子(如瘦素、TNF-α)釋放的增加以及來(lái)自脂肪細(xì)胞游離脂肪酸的增多刺激了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和局部炎癥應(yīng)答，激活的巨噬細(xì)胞釋放附加的前炎癥分子，這些分子使炎癥應(yīng)答持續(xù)發(fā)生并損傷了脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性〔10〕。因此，進(jìn)一步研究chemerin對(duì)于炎癥反應(yīng)和代謝功能的系統(tǒng)行為將很有意義。

MCP-1是趨化因子CC亞家族的一員，在體內(nèi)由脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，是一種單核細(xì)胞趨化和激活因子，主要趨化單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，使各種炎性細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞向病變部位聚集。作為一種炎癥趨化因子，MCP-1可能參與肥胖的發(fā)生和發(fā)展〔11～13〕，而肥胖引起胰島素抵抗主要與脂肪組織炎性因子和炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活有關(guān)。一方面，脂肪細(xì)胞數(shù)目增多和體積增大，可刺激脂肪組織分泌CRP、TNF-α和IL-6等炎性因子；另一方面脂肪組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞作為炎性細(xì)胞也分泌大量的炎性因子，抑制脂肪細(xì)胞的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起脂肪細(xì)胞廣泛溶解，釋放大量游離脂肪酸，導(dǎo)致胰島素抵抗。MCP-1是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由外周血循環(huán)進(jìn)入脂肪組織并使其激活的關(guān)鍵介質(zhì)，同時(shí)也是一種胰島素反應(yīng)因子。因此，進(jìn)一步分泌的胰島素又能促進(jìn)脂肪細(xì)胞等表達(dá)和分泌MCP-1，加重胰島素抵抗的進(jìn)展〔14〕。chemerin蛋白可能刺激了樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化性和MCP-1作為一種炎癥趨化因子在肥胖發(fā)生和發(fā)展中所起的作用，本研究表明脂肪細(xì)胞中chemerin水平的升高可能作用于MCP-1，而后者誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由外周血循環(huán)進(jìn)入脂肪組織并使其激活，這可能是肥胖和胰島素抵抗等疾病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一。

綜上所述，重組chemerin蛋白干預(yù)成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞后，使visfatin和MCP-1基因表達(dá)量上調(diào)。而在這個(gè)過程中visfatin和MCP-1基因的表達(dá)是如何被調(diào)控的，兩個(gè)基因又是如何調(diào)控脂肪細(xì)胞分化成熟的，在肥胖相關(guān)的代謝綜合征發(fā)生發(fā)展過程中是如何起作用的還均有待于進(jìn)一步研究。

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