針刺治療對COPD模型大鼠Th1/Th2細胞亞群格局的影響

程 淼 張新芳 張 潔 蔡圣榮 周傳云 翟從永 盛東亞 劉 睿 劉自兵

(安徽中醫(yī)藥大學針灸骨傷臨床學院針灸經(jīng)絡研究所，安徽 合肥 230038)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，氣流受限并呈進行性發(fā)展，其反復發(fā)作將損害機體免疫系統(tǒng)的功能，而免疫功能低下可使呼吸道感染率和病死率明顯增加〔1〕。輔助性T淋巴細胞(T cell helper，Th)亞群與COPD的發(fā)生具有重要關系〔2，3〕。最近有人觀察到COPD患者存在Th1/Th2平衡失調(diào)〔4〕。在正常情況下，Th1/Th2 細胞處于相對平衡的狀態(tài)，但機體發(fā)生功能異常時，常表現(xiàn)出平衡偏向其中一方，此即為“Th1/Th2平衡漂移”。一旦Th1/Th2 之間的平衡狀態(tài)被打破，很可能造成人體細胞因子網(wǎng)絡的動態(tài)平衡被破壞，進而引起許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)展。故在綜合治療COPD的同時，積極有效地改善COPD患者體內(nèi)的免疫平衡狀態(tài)，增強機體的免疫功能，對減慢病程進展、提高患者生活質(zhì)量尤為重要。臨床觀察和大量實驗研究資料證實針刺具有調(diào)整和增強機體免疫功能的作用，從而起到防病、治病“扶正固本”的功效〔5〕。但針刺是否能調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡失調(diào)，尚未見報道。因此，本實驗通過電針COPD模型大鼠，檢測外周血漿及肺泡灌洗液中IFN-γ和IL-4的含量，分析針刺對Th1/Th2平衡失調(diào)的調(diào)節(jié)作用，為臨床應用針刺治療COPD，改善免疫功能提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1動物分組及模型復制 實驗用SPF級Sprague-Dawley 雄性大鼠40只，購自上海必凱實驗動物有限公司〔許可證號：SCXK(滬)2008-0016，合格證號：2008001619110〕，體重為160～180 g，適應性喂養(yǎng)1 w。隨機分為正常對照組、模型組、電針7次組和電針14次組，每組10只。COPD模型大鼠的造模方法參照文獻并進行了改良〔6〕：將模型和電針組30只大鼠于煙熏前1 d及煙熏第15天，以6%水合氯醛麻醉，頸部切口，分離氣管，以1 ml注射器氣管內(nèi)注射濃度1 mg/ml的脂多糖溶液，200 μg/鼠，術后40萬單位青霉素抗炎。煙熏時，將大鼠置于自制1 m3的煙熏箱內(nèi)，將30支紅三環(huán)牌香煙(焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.8 mg/支，煙氣一氧化碳量15 mg；安徽中煙工業(yè)公司)點燃放入箱內(nèi)，每天下午4點進行煙熏，每日45 min，自由進食進水，連續(xù)煙熏12 w。對照組大鼠呼吸潔凈空氣。

1.2電針方法 煙熏第9周開始，電針組大鼠在煙熏前接受電針治療，大鼠以6%的水合氯醛輕度麻醉(240 mg/kg，低于正常麻醉劑量420 mg/kg)，適當刺激大鼠尚能爬行，針刺結束時大鼠即可自由活動。穴位取雙側足三里(ST36，即后三里，定位于大鼠膝關節(jié)后外側，在腓骨小頭下方5 mm，脛腓骨間隙處)、肺俞穴(BL13，定位于大鼠背部第三胸椎下兩旁肋間)〔5〕，針灸針柄以導線聯(lián)接華佗牌SDZ-V型程控多功能電針治療儀(蘇州產(chǎn))，參數(shù)采用4/20 Hz交替頻率，強度為1級(相當于2 mA)，以引起大鼠后肢輕微抖動為度。下午2點進行針刺，每次電針治療30 min，隔日1次，分別連續(xù)針刺治療7次和14次，正常對照及模型組大鼠均以等劑量麻醉而不針刺。

1.3觀察肺功能和肺組織病理 針刺結束后次日，以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠(70 mg/kg)，氣管插管后置于大鼠體描箱，接好導管，連接呼吸機、呼吸信號調(diào)理器及負壓器，開啟計算機，打開AniRes2005動物肺功能分析軟件(北京貝蘭博科技公司)，記錄吸氣阻力(Ri)、呼氣阻力(Re)和肺動態(tài)順應性(Cydn)。大鼠處死后取肺組織，常規(guī)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，采用奧林巴斯BX51型光學顯微鏡，取200倍視野觀察并攝片。

1.4ELISA方法檢測支氣管肺泡灌洗液及血漿IFN-γ和IL-4含量 血漿采集方法：肺功能檢測結束后，以采血針取大鼠腹主動脈血置于抗凝管，4℃ 3 000 r/min離心(長沙湘儀TGL-16M型臺式冷凍離心機)15 min，取上清。支氣管肺泡灌洗液(BALF)抽取方法：大鼠取血后開胸，分離縱隔，止血鉗鉗住右總支氣管，注射器分兩次抽取3 ml生理鹽水從氣管插管推入左肺，每次反復灌洗3下后抽出灌洗液，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測BALF及血漿中IFN-γ和IL-4，試劑盒購自上海源葉生物技術有限公司(IL-4批號：12889R；INF-γ批號：12562R)，操作程序嚴格按照說明書操作。主要步驟為：①標準品的稀釋；②加樣；③配液；④洗滌；⑤顯色；⑥終止；⑦以BIO-RAD公司iMARK型號酶標儀測量450 nm波長的吸光度(OD值)；8)計算出對應的樣品濃度。

2 結 果

2.1針刺對COPD模型大鼠肺功能和肺病理的影響 在肺功能的指標中，模型組大鼠的呼氣阻力比正常對照組升高(P<0.05 )，但吸氣阻力及肺動態(tài)順應性與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，表明模型大鼠有呼氣受限；針刺7次后，吸氣和呼氣阻力均比模型組顯著下降(P<0.01 )，且肺動態(tài)順應性顯著增加(P<0.01)，表明針刺顯著改善了肺通氣功能。與針刺7次相比，針刺14次后吸氣阻力的降低和肺動態(tài)順應性增加的幅度均較低(P<0.05 )，說明針刺7次即能改善模型大鼠的肺功能。見表1。光鏡下觀察肺病理結果可見，對照組大鼠肺泡、肺間隔及小氣道結構完整、清晰、勻稱；模型組肺間隔增厚，且有大量炎性細胞浸潤，肺泡減少，小氣道管腔有大量黏液分泌及堵塞，管壁變形及增厚；電針后肺間隔變薄，肺泡面積相應增加，小氣道管腔黏液分泌及堵塞情況改善(圖1)。

表1 針刺對COPD模型大鼠的吸氣阻力、呼氣阻力及肺動態(tài)順應性的影響

A：正常對照組(肺泡結構清晰、勻稱)；B：模型組(肺間隔增厚，大量炎性細胞浸潤；小氣道管腔多見分泌物)；C:電針7次組(肺間隔變薄、氣道分泌物減少)；D：電針14次組

2.2針刺對COPD大鼠BALF及血漿中IFN-γ、IL-4的影響 ELISA方法的檢測結果顯示，與對照組相比，在模型組大鼠BALF及血漿中IFN-γ含量均非常顯著升高(P<0.001)；IL-4含量也有不同程度升高(P<0.05；P<0.01)?？梢姡琁FN-γ比IL-4含量的升高更為顯著，表明Th1細胞在模型組中占有優(yōu)勢，Th1/Th2平衡傾向于Th1(表2)。與對照組IFN-γ/IL-4比較，模型組大鼠BALF中的比值顯著降低(P<0.01)，但血漿中比值增高(P<0.05)，表明在肺的局部環(huán)境中，Th2占優(yōu)勢，而在全身反應中，依然是Th1占優(yōu)勢。見表3。

與模型組相比，在電針7次、14次組大鼠BALF及血漿中，IFN-γ和IL-4含量均有不同程度降低(P<0.05；P<0.001)，可見電針下調(diào)了模型大鼠IFN-γ、IL-4的含量；電針兩組相比，除14次組BALF中IFN-γ下調(diào)更多(P<0.01)，余均無統(tǒng)計學差異(表2)。與模型組BALF中IFN-γ/IL-4比較，電針7次組的比值顯著升高(P<0.001)，而電針14次組卻無明顯變化(P>0.05)，且與電針7次組差異顯著(P<0.001)；電針后，血漿中的IFN-γ/IL-4均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表3)。表明針刺對肺及全身的Th細胞均有調(diào)節(jié)作用，且電針7次即可發(fā)揮較大的調(diào)節(jié)效應。

表2 針刺對COPD大鼠肺泡灌洗液及血漿中IFN-γ和IL-4的影響

表3 針刺對COPD大鼠肺泡灌洗液及血漿中IFN-γ/IL-4的影響

2.3IFN-γ和IL-4與肺功能的相關性分析 以BALF和血漿中的IFN-γ和IL-4與肺功能中關鍵指標Re進行Pearson相關性分析，結果顯示，血漿中IL-4與Re呈顯著正相關(r=0.937,P<0.01)，其他無明顯相關性(r=0.293～0.479,P>0.05,n=7)，表明關鍵肺功能指標的變化可能受IL-4的影響。

3 討 論

COPD患者存在細胞免疫功能紊亂和低下〔1〕。近年來的研究發(fā)現(xiàn)部分患者在戒煙后，肺部的損害并未完全停止，仍有持續(xù)進展，因此，也有學者提出，COPD 是自身免疫性疾病的假設〔7〕。Th1與Th2細胞之間的動態(tài)平衡對維持機體正常的免疫功能起重要作用，Th1細胞功能亢進可促進某些器官特異性自身免疫病的發(fā)展。Th細胞亞群平衡失調(diào)與COPD這一炎癥性疾病的發(fā)生具有重要關系〔8，9〕。

研究者多以檢測IFN-γ和IL-4(或IL-10)的含量及IFN-γ/IL-4，來反映Th1和Th2細胞亞群，并分析Th1/Th2免疫平衡〔10〕。在呼吸疾病中，一般認為，哮喘氣道炎癥主要與Th2功能亢進相關，COPD氣道炎癥主要與Th1細胞相關，但也有研究表明COPD與哮喘一樣均表現(xiàn)為Th2功能亢進特征〔4〕。本實驗動物模型符合COPD在病理和肺功能上的特點，同時，Th1細胞占有優(yōu)勢，Th1/Th2平衡格局傾向于Th1。

COPD病程復雜，最近Tsoumakidou等〔11〕根據(jù)COPD臨床分期的不同，觀察到急性加重期Th細胞平衡可能表現(xiàn)出與穩(wěn)定期不同的特點，急性加重期Th1細胞平衡呈現(xiàn)出向Th2端漂移的特點。且COPD炎癥機制復雜，與經(jīng)典的Th1或Th2介導的自身免疫性疾病相比，缺乏典型的特征〔12〕。故在臨床上，經(jīng)典的免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑治療收效甚微。

針刺是我國傳統(tǒng)中醫(yī)療法，用于治療和預防疾病已有數(shù)千年的歷史。針刺治療呼吸系統(tǒng)疾病，一直受到針灸學者的重視。早在1961年薩藤山川等報道針刺可使哮喘患者呼吸道的阻力下降。1981年張笑平報道連續(xù)針刺肺俞穴1 w可使哮喘患者的肺通氣量明顯增加，且停針后其效應仍可維持較長時間。1997年張壓西等發(fā)現(xiàn)針刺肺俞穴能明顯改善肺通氣功能，在肺俞穴不同的留針時間對患者的肺通氣功能有不同的改善。德國〔13〕和日本學者〔14〕的研究均發(fā)現(xiàn)COPD患者用針刺進行治療，治療14 d后肺通氣功能顯著得到改善，生活質(zhì)量也有較大程度的提高。針刺不僅可以改善肺及支氣管的通氣功能,調(diào)節(jié)大、中、小氣道阻力，而且對人體的免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用〔15〕。

Yamaguchi等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)針刺中醫(yī)經(jīng)穴能上調(diào)正常成年人CD2+、CD4+、CD8+等細胞及IL-4，IL-1β和IFN-γ的水平。本實驗中選取肺俞和足三里穴進行針刺，因為中醫(yī)理論認為，肺俞穴是足太陽膀胱經(jīng)的重要穴位，是肺的“背俞穴”，肺俞穴為肺氣所輸注的部位，能疏泄肺氣，又是肺臟氣血在背部的反映點,可以接受針灸刺激，并通過其經(jīng)絡系統(tǒng)，對肺臟氣血起調(diào)節(jié)作用，損有余而補不足，使人體氣血陰陽維持動態(tài)平衡。針灸肺俞穴可明顯提高健康人的用力肺活量。該穴不僅是臨床治療和研究中應用最廣泛的穴位，也是目前基礎研究針灸調(diào)節(jié)肺臟功能的常用穴位。足三里穴是足陽明胃經(jīng)之合穴,“胃者五臟六腑之海也。水谷皆入于胃，五臟六腑之氣皆稟于胃”， 又脾胃互為表里，為后天之本，氣血生化之源，是機體生命活動的基礎。足三里穴為胃經(jīng)之要穴，具有理脾胃、調(diào)氣血、補虛弱、宣暢氣機等諸多功效而倍受關注。大量的研究證實，針灸足三里穴具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，且這種作用具有整體性和雙向性〔17〕，在呼吸系統(tǒng)疾病的研究中，發(fā)現(xiàn)針灸或穴位注射足三里穴均可使支氣管哮喘者過低的CD8+細胞升高，使增大的CD4+/ CD8+細胞比值縮小，過高的IL-4和IgE降低，控制哮喘的發(fā)病〔18〕。本實驗模型大鼠經(jīng)針刺后，肺通氣功能和肺病理得到一定程度的改善，且針刺能抑制Th1細胞，使Th1/Th2格局趨于平衡，且針刺7次即有調(diào)節(jié)作用。但針刺調(diào)節(jié)Th1/Th2似乎以肺為主，是否與肺的局部炎癥反應有關，尚需進一步研究。

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