眼針對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦皮層組織FADD表達(dá)的影響

趙丹玉 王 哲 曹 陽(yáng) 王德山

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847)

眼針療法為我校著名老中醫(yī)彭靜山教授所創(chuàng)，是一種微針療法。百余萬(wàn)病例實(shí)踐證明，眼針對(duì)于急性腦中風(fēng)以及頑固性疼痛等優(yōu)勢(shì)病種療效顯著，但是其機(jī)制尚不清楚。本課題建立大鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)模型，研究眼針對(duì)于CIRI大鼠損傷側(cè)大腦皮層組織Fas相關(guān)凋亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)表達(dá)的影響，研究眼針對(duì)于CIRI的作用機(jī)制,為“眼絡(luò)于腦”的中醫(yī)理論假說(shuō)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體重280～320 g。購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可號(hào)：SCXK(滬)2008-0016。RNAiso Reagent和RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；SABC免疫組織化學(xué)試劑盒、一抗FADD、GAPDH多克隆抗體及山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動(dòng)物分組與模型復(fù)制 大鼠以隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、假手術(shù)組、模型組和眼針組，剔除造模不成功以及死亡鼠，最終每組保證至少18只。正常組：常規(guī)喂養(yǎng)無(wú)任何施加因素。模型復(fù)制與成模標(biāo)準(zhǔn)：采用改良的線(xiàn)栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血(MACO)再灌注動(dòng)物模型(右側(cè)栓塞)〔1〕。造模后參照Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分〔2〕。以神經(jīng)功能缺損評(píng)分≥1分者視為造模成功。將造模成功的大鼠再隨機(jī)分為模型組和眼針組。假手術(shù)組：術(shù)式與操作基本過(guò)程同模型組和眼針組，只是不進(jìn)行大腦中動(dòng)脈栓塞。模型組常規(guī)喂養(yǎng)，不給予任何刺激。眼針組在缺血再灌注即刻、造模術(shù)后12 h及造模術(shù)后24 h即處死前各針刺1次。

1.3眼針取穴與刺法 取穴參照人體取穴定位法分別?。荷辖箙^(qū)、下焦區(qū)、肝區(qū)、腎區(qū)〔3〕；刺法：用35 mm×25 mm毫針在相應(yīng)眼穴區(qū)距眶內(nèi)緣2 mm處，平刺，由該區(qū)始點(diǎn)向該區(qū)終點(diǎn)方向，刺入0.3 cm，行捻轉(zhuǎn)手法，留針30 min，15 min行針1次，時(shí)間1 min。

1.4RT-PCR檢測(cè)FADD mRNA表達(dá) 于造模術(shù)后24 h每組各取6只鼠，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,迅速斷頭取腦，分離右側(cè)皮層組織?？俁NA提取用RNAiso Reagent試劑，按說(shuō)明操作。提取后的總RNA以分光光度法鑒定其純度。用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)。FADD的引物序列為：正義鏈CTGGGCAGACACGACCTAC，反義鏈TCCCTTACCCGATCACTCA，長(zhǎng)度：221 bp，退火溫度：65℃；β-actin的引物序列為：正義鏈GCACCAAGTGCCACAAAGGAA，反義鏈TGCGAAGCTGTAAAGGTGCCT，長(zhǎng)度：592 bp，退火溫度：65℃。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，拍照，凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行吸光度積分分析(IOD)，以FADD的RT-PCR產(chǎn)物IOD和內(nèi)參β-actin的RT-PCR產(chǎn)物的IOD比值顯示FADD mRNA的表達(dá)變化。

1.5免疫組化檢測(cè)FADD蛋白表達(dá) 于造模術(shù)后24 h每組各取6只鼠，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，先后用生理鹽水及4 %多聚甲醛心內(nèi)灌流，迅速斷頭取腦，取額極至中腦間腦組織冠狀面置于4%多聚甲醛中后固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，每隔100 μm連續(xù)作5 μm厚腦冠狀面石蠟切片。石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟按即用型SABC免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。最后于高倍物鏡下觀察、照相及圖像處理分析，測(cè)定平均光密度值(MOD)。每張切片測(cè)定6個(gè)視野取平均值作為測(cè)定值。

1.6Western印跡檢測(cè)FADD蛋白表達(dá) 于造模術(shù)后24 h每組各取6只鼠，麻醉后,迅速斷頭取腦，于無(wú)菌條件下冰上分離右側(cè)皮層組織，加入相應(yīng)體積的裂解液后勻漿， 12 000 r/min離心30 min，收集上清，檢測(cè)各樣本蛋白濃度。將樣品和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)分別加入膠孔內(nèi)開(kāi)始電泳。電泳完畢，半干式轉(zhuǎn)印槽印跡約1.5 h，封閉，37℃，2 h，加入適當(dāng)稀釋的一抗(FADD、GAPDH均以1∶100用封閉液稀釋)，4℃過(guò)夜。TBST沖洗后加入1∶2 000稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃，45 min。DAB顯色。掃描硝酸纖維素膜上的條帶，凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行吸光度積分分析(IOD)，以GAPDH作為內(nèi)參，各組IKKβ、NF-κB的蛋白表達(dá)強(qiáng)度IOD和內(nèi)參GAPDH的蛋白表達(dá)強(qiáng)度IOD比值顯示各組IKKβ、NF-κB的蛋白表達(dá)變化

2 結(jié) 果

2.1眼針對(duì)CIRI 模型大鼠一般狀態(tài)影響 假手術(shù)組大鼠手術(shù)完成動(dòng)物蘇醒后，無(wú)神經(jīng)功能缺損體征出現(xiàn)，根據(jù)神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，平均為0分。造模成功的大鼠蘇醒后出現(xiàn)明顯的不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及向?qū)?cè)傾倒等神經(jīng)功能缺損癥狀。術(shù)后24 h,模型組動(dòng)物神經(jīng)功能缺損癥狀隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，神經(jīng)功能缺損評(píng)分具有明顯上升趨勢(shì)；眼針組神經(jīng)功能缺損癥狀加重不明顯，顯示出眼針治療的腦保護(hù)作用。

2.2眼針對(duì)CIRI模型大鼠大腦皮層組織FADD mRNA 表達(dá)影響 通過(guò)對(duì)電泳的結(jié)果以及凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行吸光度積分分析，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1、圖2、表1所示，正常組及假手術(shù)組大鼠右側(cè)大腦皮層組織FADD的 mRNA 均表達(dá)較少，二者之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；同正常組與假手術(shù)組相比較，CIRI模型組FADD呈現(xiàn)明顯高表達(dá)(P<0.01)；而眼針組的表達(dá)較模型組明顯下降(P<0.01)。

1、2、3泳道：正常組；4、5、6泳道：假手術(shù)組；7、8、9泳道：模型組；10、11、12泳道：眼針組

1、2、3泳道：正常組；4、5、6泳道：假手術(shù)組；7、8、9泳道：模型組；10、11、12泳道：眼針組

表1 眼針對(duì)CIRI模型大鼠缺血側(cè)大腦皮層組織FADD表達(dá)的影響

2.3眼針對(duì)CIRI模型大鼠大腦皮層組織FADD蛋白表達(dá)影響

2.3.1免疫組化結(jié)果 以圖3、表1所示，染色結(jié)果可見(jiàn)，正常組及假手術(shù)組大鼠右側(cè)大腦皮層組織鮮見(jiàn)的FADD陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。CIRI模型組可見(jiàn)較多的FADD陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿著色，與正常組和假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01)；眼針組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，同模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.2Western印跡結(jié)果 通過(guò)對(duì)免疫印跡的結(jié)果進(jìn)行吸光度積分分析，如圖4、圖5及表1所示，正常組及假手術(shù)組大鼠右側(cè)大腦皮層組織FADD蛋白均表達(dá)較少，二者之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；同正常組與假手術(shù)組相比較，CIRI模型組FADD呈現(xiàn)明顯高表達(dá)(P<0.01)；而眼針組表達(dá)較模型組明顯下降(P<0.01)。

圖3 眼針對(duì)CIRI模型大鼠缺血側(cè)大腦皮層組織FADD蛋白表達(dá)影響(IHC，DAB染色，×400)

1：正常組；2：假手術(shù)組；3：模型組；4：眼針組

1：正常組；2：假手術(shù)組；3：模型組；4：眼針組

3 討 論

CIRI在腦血管病的發(fā)病及相應(yīng)的治療過(guò)程中起重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CIRI與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系〔3〕，凋亡機(jī)制參與CIRI已成為臨床研究的熱點(diǎn)。凋亡主要發(fā)生在半暗帶區(qū)，即介于缺血壞死灶和正常組織之間的區(qū)域，半暗帶凋亡的發(fā)生參與梗死灶的發(fā)展,最終決定腦梗死的體積〔4，5〕。改善半暗帶區(qū)的細(xì)胞凋亡是防治CIRI重點(diǎn)要解決的問(wèn)題。

神經(jīng)元凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，在不同的刺激信號(hào)影響下，涉及多個(gè)基因表達(dá)及相互作用的復(fù)雜過(guò)程〔6〕。死亡受體通路是導(dǎo)致凋亡的重要信號(hào)通路。死亡受體通路包括Fasl/Fas和TNFα/TNFR1兩條通路。FADD是死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要的連接蛋白。FADD是存在于胞漿中的一種含死亡結(jié)構(gòu)域(DD)的連接蛋白。分子中包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即C末端的DD和N末端的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)。DD結(jié)構(gòu)域是FADD與其上游分子Fas、TRADD(TNFR1的下游分子)結(jié)合的部位；DED結(jié)構(gòu)域是其誘導(dǎo)凋亡的活性部位，而且已證明FADD的DED寡聚化作用,足以引起凋亡的發(fā)生。由此可見(jiàn)，F(xiàn)ADD是Fas1/Fas和TNFα/TNFR1兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同的連接分子，在凋亡的發(fā)生過(guò)程中處于中心環(huán)節(jié)。

彭靜山教授所創(chuàng)的眼針療法根據(jù)中醫(yī)目診的基本理論“八廓學(xué)說(shuō)”，用后天八卦將眼睛分為八區(qū)，并根據(jù)《證治準(zhǔn)繩》《目門(mén)》卷七中引用華佗的話(huà)將眼周分為十三穴，根據(jù)各區(qū)內(nèi)白睛脈絡(luò)的變化，配以臟腑，用以“觀眼識(shí)病”并根據(jù)具體病情辯證取穴。中風(fēng)之發(fā)生，病機(jī)較復(fù)雜.歸納起來(lái)不外虛、火、風(fēng)、痰、氣、血六端，其中以肝腎陰虛為其根本，此六端在一定條件下，互相影響，相互作用而突然發(fā)病。心、肝、腎三臟陰陽(yáng)失調(diào)是中風(fēng)重要病機(jī)，肝腎陰虛，肝陽(yáng)偏亢。因此眼針取穴取肝區(qū)平肝潛陽(yáng)，調(diào)暢氣機(jī)，調(diào)理藏血；取腎區(qū)以滋陰補(bǔ)腎，填精益髓，從而使肝血腎精充盛。

本課題前期研究表明,眼針可以有效抑制缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡，改善局部缺血缺氧從而改善缺血半暗區(qū)微循環(huán)，對(duì)腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同正常組及假手術(shù)組相比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯增高，結(jié)合本課題其他檢測(cè)指標(biāo)〔8，9〕，說(shuō)明CIRI造模成功。模型組大鼠缺血側(cè)大腦皮層組織中FADD的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于正常組及假手術(shù)組，提示CIRI狀態(tài)下，F(xiàn)ADD表達(dá)顯著增強(qiáng)，同以往的研究結(jié)果一致〔10〕。眼針治療后大鼠神經(jīng)功能缺損狀況顯著改善，F(xiàn)ADD基因及蛋白表達(dá)明顯下降。作為死亡受體通路的中心物質(zhì)表達(dá)降低，提示死亡受體通路極可能被抑制，從而半暗帶區(qū)細(xì)胞的凋亡受到抑制，起到防止梗死灶迅速擴(kuò)大，保護(hù)腦組織的作用，這可能是眼針抑制CIRI半暗帶區(qū)的凋亡的主要機(jī)制之一。FADD表達(dá)的下調(diào)是否為眼針刺激對(duì)于整個(gè)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，還待今后作進(jìn)一步的研究。

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