老年女性原發(fā)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中FoxP3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

任偉民 張友元 董軍明 羅金芳 賀國(guó)慶 顧立新

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院病理科，上海 201508)

乳腺癌尤其是浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌是老年女性常見的惡性腫瘤之一〔1〕，發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌預(yù)后相對(duì)較差，治療效果不夠滿意。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(FoxP3)是調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)的特異性標(biāo)記之一〔2〕，后者與乳腺癌密切相關(guān)，同時(shí)FoxP3作為轉(zhuǎn)錄因子本身亦發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)FoxP3蛋白在老年乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)來(lái)探討其意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本 選取復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院病理科2009年1月至2011年12月外科手術(shù)切除的老年乳腺癌標(biāo)本存檔蠟塊75例，所有病例均經(jīng)病理切片證實(shí)為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌非特殊類型，診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照WHO2003乳腺癌的分類且腋下淋巴結(jié)檢出數(shù)≥15枚〔3〕，所有病例均為女性，其中老年組(年齡>60歲)28例，平均年齡〔68.92±7.02(60～85)〕歲，11例伴腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；老年前期組(>45歲，≤60歲)32例，平均年齡〔53.15±3.84(45～58)〕歲，9例伴腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；青年期組(≤45歲)15例，平均年齡〔39.69±4.10(29～44)〕歲，5例伴腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2試劑 鼠抗人FoxP3單克隆抗體(Santa Cruz公司，1∶50稀釋)，HRP標(biāo)記二抗、(DAB)顯色液、檸檬酸緩沖修復(fù)液(pH6.0)(均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司)。

1.3方法 采用免疫組化EnVision兩步法，按照試劑盒規(guī)定步驟進(jìn)行操作：常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫3 min，檸檬酸緩沖液熱修復(fù)30 min，滴加一抗后4℃過(guò)夜，滴加二抗30 min，(DAB)顯色，所有步驟間均PBS沖洗，蘇木素襯染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以試劑盒的陽(yáng)性圖片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷 FoxP3定位于Treg細(xì)胞的細(xì)胞核和癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。采用免疫組化分?jǐn)?shù)進(jìn)行半定量分析〔4〕。每張切片觀察10個(gè)高倍視野，分別給予陽(yáng)性評(píng)分。 癌細(xì)胞：按染色強(qiáng)度分為0分(無(wú)染色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)和3分(棕褐色)；按染色比例分為0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%)。兩者分?jǐn)?shù)相加計(jì)算總分，≤6為低表達(dá)，>6為高表達(dá)。 FoxP3+淋巴細(xì)胞(Treg)評(píng)分：0分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1分，≤3個(gè)視野，每視野1～3個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞；2分，>3個(gè)視野，每視野1～3個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞；3分，>3個(gè)視野，每視野>3個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。0分和1分為低表達(dá)，2分和3分為高表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采取χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1不同年齡組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌癌組織中FoxP3的表達(dá) 三個(gè)年齡組相比較，癌組織FoxP3和癌周FoxP3+淋巴細(xì)胞總體表達(dá)有差異(P<0.05)，與青年組相比，老年組顯示癌組織FoxP3表達(dá)升高，同時(shí)癌周FoxP3+淋巴細(xì)胞數(shù)也高表達(dá)(P<0.05)，但相較老年前期病例組，老年組癌組織FoxP3及癌周FoxP3+淋巴細(xì)胞均與其未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.2不同年齡組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中FoxP3蛋白的差異表達(dá) 三個(gè)年齡組中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞FoxP3表達(dá)及FoxP3+淋巴細(xì)胞數(shù)量高于相應(yīng)原發(fā)灶，但老年前期及青年期組未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而老年組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖1。

圖1 不同年齡組乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中FoxP3表達(dá)(EnVision法，×400)

2.3FoxP3表達(dá)與老年乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系 癌組織FoxP3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Her2表達(dá)呈統(tǒng)計(jì)學(xué)正相關(guān)(P<0.05)，與ER呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小和PR未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(P>0.05)；癌周浸潤(rùn)的FoxP3+淋巴細(xì)胞與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Her2呈統(tǒng)計(jì)學(xué)正相關(guān)，與ER、PR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(P>0.05)。見表3。

表1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌癌組織中FoxP3的表達(dá)(n)

表2 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及對(duì)應(yīng)原發(fā)灶中FoxP3蛋白的表達(dá)(n)

表3 FoxP3表達(dá)與老年乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

3 討 論

FoxP3與Treg的分化決定和功能密切相關(guān)，最初對(duì)其研究集中在自身免疫性疾病方面，隨著研究深入，大量事實(shí)表明Treg在腫瘤免疫抑制方面發(fā)揮了重要作用。在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Treg的存在，乳腺癌中Treg與其預(yù)后相關(guān)性也得到證實(shí)〔5〕。目前認(rèn)為Treg主要分為3個(gè)亞群：CD4+Treg細(xì)胞、CD8+Treg細(xì)胞和γδ-TCR，而CD4+Treg又進(jìn)一步分為自然發(fā)生的CD4+CD25+FoxP3+ Treg、抗原誘導(dǎo)的CD4+CD25+FoxP3+ Treg和CD4+FoxP3-Trl細(xì)胞〔6〕。乳腺癌中FoxP3+Treg增多被認(rèn)為是機(jī)體對(duì)乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化的反應(yīng)，并且被作為腫瘤進(jìn)展的指標(biāo)〔7〕。多種因子能夠直接或間接與Treg反應(yīng)而發(fā)揮功能作用，TGF通路是Treg較為重要的作用機(jī)制之一，在腫瘤進(jìn)展尤其是轉(zhuǎn)移過(guò)程中極大地影響了腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散能力。首先Treg表達(dá)細(xì)胞因子受體CCR4，受其配體CCL5、CCL17、CCL22等因子吸引聚集到腫瘤部位，激活后分泌大量TGF-β，后者通過(guò)各種途徑加速腫瘤進(jìn)展，比如介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)高表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤血管生成〔8〕,Treg還與某些癌基因存在相互作用,如K-ras等，但具體機(jī)制尚不明確。

目前研究發(fā)現(xiàn)FoxP3還是X染色體連鎖的抑制基因，表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞，包括乳腺癌、肺癌、腸癌、黑色素瘤等〔9〕，在乳腺癌細(xì)胞上表達(dá)的FoxP3與預(yù)后相關(guān)，尤其是乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移者〔10〕。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxP3具有多種作用影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，近期研究認(rèn)為FoxP3對(duì)乳腺癌癌基因SKP2和Her2存在轉(zhuǎn)錄抑制作用〔11，12〕。盡管FoxP3通常與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)，但最近有研究發(fā)現(xiàn)在Her2過(guò)表達(dá)的乳腺癌亞型中，F(xiàn)oxP3陽(yáng)性表達(dá)與預(yù)后較好相關(guān)，具有獨(dú)立的預(yù)后意義，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制乳腺癌Her2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而一定程度上對(duì)抗癌基因Her2的相關(guān)作用，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)乳腺癌發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔3〕，提示腫瘤本身的特性是FoxP3發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。與吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)的協(xié)同作用也是可能的促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制〔13〕。

FoxP3促進(jìn)乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚未明確，可能從兩方面起作用：一方面FoxP3+淋巴細(xì)胞(Treg)具有免疫抑制的作用，可通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間直接接觸或通過(guò)分泌某些炎癥調(diào)節(jié)因子來(lái)間接調(diào)節(jié)，升高的Treg對(duì)機(jī)體的抗瘤免疫產(chǎn)生抑制，促進(jìn)了癌組織的免疫逃避從而較容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。另一方面，乳腺癌組織表達(dá)的FoxP3可連接癌細(xì)胞表達(dá)化學(xué)因子受體CCR7和CXCR4，上調(diào)其轉(zhuǎn)錄、表達(dá)〔10〕，促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

國(guó)內(nèi)目前尚未針對(duì)乳腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行對(duì)比研究，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癌組織FoxP3蛋白表達(dá)及癌周FoxP3+淋巴細(xì)胞在老年患者中均有所升高，一個(gè)可能的原因是隨著年齡增加，免疫系統(tǒng)的功能逐漸減弱，導(dǎo)致乳腺癌患者腫瘤免疫效能偏低下。一些國(guó)外研究顯示FoxP3+淋巴細(xì)胞與ER、PR負(fù)相關(guān)，與組織分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Her2正相關(guān)〔14，15〕，F(xiàn)oxP3的mRNA也檢測(cè)到在PR陰性或Her2陽(yáng)性的乳癌中高表達(dá)〔16〕，但是否FoxP3的表達(dá)具有一定的區(qū)域人群間差異尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。相對(duì)原發(fā)灶而言，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)FoxP3+淋巴細(xì)胞(Treg)增多，預(yù)示組織局部免疫狀態(tài)的改變，同時(shí)轉(zhuǎn)移灶中癌組織本身FoxP3蛋白也表達(dá)升高，提示FoxP3可能與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)，可以作為老年女性發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的治療靶點(diǎn)之一，反之，在作靶向治療時(shí)也要考慮到原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的差異性，制定合理的化療、放療方案。盡管FoxP3和FoxP3+淋巴細(xì)胞作為重要的因素影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，但是并非單獨(dú)發(fā)揮作用，許多復(fù)雜的機(jī)制參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，將FoxP3作為影響老年乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的唯一指標(biāo)而進(jìn)行處置是不可取的。

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