AEG-1表達(dá)對(duì)老年宮頸癌SiHa細(xì)胞周期的影響及相關(guān)機(jī)制

高婷婷

(寧波市中心醫(yī)院，浙江 寧波 315000)

宮頸癌常見(jiàn)鱗狀細(xì)胞癌，是臨床多發(fā)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，尤其對(duì)于老年患者，其復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移成為導(dǎo)致患者死亡的重要因素之一。腫瘤轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞與宿主細(xì)胞相互作用的連續(xù)復(fù)雜過(guò)程。這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程是由一系列基因調(diào)控系統(tǒng)組成。研究〔1〕表明，星形細(xì)胞上調(diào)基因(AEG)-1與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在唾液腺癌、原發(fā)性膽囊癌、卵巢癌和乳腺癌等組織中發(fā)現(xiàn)AEG-1的表達(dá)異常升高；AEG-1在宮頸癌組織中的表達(dá)也顯著高于正常組織〔2〕，提示AEG-1可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其分子機(jī)制尚需探討。本研究對(duì)siRNA介導(dǎo)的AEG-1表達(dá)沉默的人宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa的周期性變化進(jìn)行研究，并對(duì)其發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 人正常宮頸組織以及宮頸癌組織均來(lái)自于我院近年來(lái)收治的宮頸癌患者以及健康體檢人群，實(shí)驗(yàn)組織均經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查確認(rèn)。SiHa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640培養(yǎng)液和胰蛋白酶均購(gòu)自GIBCO公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，AEG-1-siRNA、siRNA和兔多克隆抗體AEG-1均為美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品，鼠單克隆抗體cdk2以及兔多克隆抗體eyelin D1均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染 SiHa細(xì)胞復(fù)蘇后，置含5%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基中。達(dá)到85%～95%細(xì)胞融合度時(shí)，按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明，以siRNA和AEG-1-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞分為三組：未轉(zhuǎn)染組(不作任何處理)、siRNA對(duì)照組和AEG-1-siRNA轉(zhuǎn)染組。

1.2.2Western印跡測(cè)定蛋白表達(dá) 裂解細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)1×107加100 μl lysis buffer)，根據(jù)樣品蛋白濃度，按蛋白總量50 μg計(jì)算體積。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)垂直電泳200 V 90 min，100 V濕法轉(zhuǎn)膜。分別結(jié)合I抗〔AEG-1抗體，細(xì)胞周期蛋白(cyclin D1)、CDK2、β-actin抗體〕，4℃過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液(TBS/T)清洗5 min×3遍后，結(jié)合Ⅱ抗(HRP-la-beled羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG抗體)，室溫1 h，溫和振蕩。TBS/T振蕩清洗5 min×3遍。至暗房，加電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色液作用1 min，感光、洗片。將所得照片掃描，輸入計(jì)算機(jī)，用Quantity one軟件掃描得吸光度值，以AEG-1、細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、CDK2與β-actin平均吸光度比值做定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)SiHa細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染后48 h的SiHa細(xì)胞(每組約1×106個(gè))，以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，置4℃ 70%冰乙醇固定30 min。冷PBS漂洗3次，然后重懸細(xì)胞于含40 μg碘化丙啶和100 μg RNaseA的PBS溶液中，于37℃孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品DNA含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較使用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1正常組織、細(xì)胞與宮頸癌組織、細(xì)胞中AEG-1的表達(dá) 正常宮頸組織的AEG-1蛋白表達(dá)量(0.03±0.01)顯著低于宮頸鱗癌組織中的蛋白表達(dá)量(0.41±0.07)(P<0.05)；SiHa細(xì)胞中的AEG-1蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照細(xì)胞中AEG-1蛋白表達(dá)量(0.13±0.16)(P<0.05)。

AEG-1-siRNA對(duì)SiHa細(xì)胞中AEG-1表達(dá)有顯著地下調(diào)作用(P<0.05)，AEG-1-siRNA轉(zhuǎn)染組SiHa細(xì)胞中AEG-1表達(dá)量(0.16±0.07)顯著低于未轉(zhuǎn)染組(0.79±0.11)以及對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組(0.81±0.12)(P<0.05)。

2.2AEG-1表達(dá)的下調(diào)可以顯著增加SiHa細(xì)胞在G0/G1期的數(shù)量(P<0.05)。AEG-1-siRNA組SiHa細(xì)胞在G0/G1期的比例顯著高于未轉(zhuǎn)染組以及siRNA對(duì)照組(P<0.05)。AEG-1-siRNA組SiHa細(xì)胞在S期的比例顯著低于未轉(zhuǎn)染組以及siRNA對(duì)照組(P<0.05),且AEG-1-siRNA組細(xì)胞中cyclin D1以及CDK2等蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照siRNA組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AEG-1表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響

3 討 論

近年來(lái)，隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，如何從分子水平闡明宮頸鱗癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機(jī)制，尋求理想的分子指標(biāo)進(jìn)行預(yù)后評(píng)估，是降低宮頸鱗癌患者病死率的有效途徑之一。AEG-1是近年發(fā)現(xiàn)的新的基因。隨著對(duì)AEG-1的深入研究，發(fā)現(xiàn)AEG-I不僅促進(jìn)神經(jīng)退行性變的發(fā)生，還促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵基因〔3〕。AEG-1參與了多種調(diào)控細(xì)胞增殖、凋產(chǎn)和轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路的激活。

研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，AEG-1可以激活腫瘤細(xì)胞增殖途徑并且減少腫瘤細(xì)胞凋亡，因此可以促進(jìn)其增殖。在乳腺惡性腫瘤和前列腺惡性腫瘤的相關(guān)臨床研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期抑制因子表達(dá)的下調(diào)有可能與AEG-1表達(dá)的上調(diào)有因果關(guān)系，這些變化可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，有研究表明〔5〕，在神經(jīng)母細(xì)胞腫瘤中，抑制AEG-1表達(dá)可以引起細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞分裂增殖。為深入研究AEG-1在宮頸惡性腫瘤中發(fā)揮的作用，以AEG-1表達(dá)量最多的SiHa細(xì)胞為研究對(duì)象，使用AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，研究顯示AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染后48 h，AEG-1蛋白表達(dá)量出現(xiàn)明顯降低，這一結(jié)果為深入研究AEG-1在宮頸惡性腫瘤中發(fā)揮的作用提供了良好的基礎(chǔ)。現(xiàn)利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究分析，觀察轉(zhuǎn)染前后SiHa細(xì)胞周期分布的變化，結(jié)果顯示AEG-1 siRNA組中停滯在G0/G1期的SiHa細(xì)胞比率大大高于對(duì)照siRNA組和未作任何處理組，而且S期細(xì)胞的比率也比對(duì)照siRNA組和未作任何處理組于要高，這一結(jié)果顯示AEG-1表達(dá)下調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，進(jìn)而可以降低宮頸惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。深入研究分析表明〔6〕，AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染后，與細(xì)胞分裂增殖關(guān)系較密切的cdk2和cyclin D1蛋白的表達(dá)也出現(xiàn)明顯降低，這表明AEG-1誘導(dǎo)出現(xiàn)的宮頸惡性腫瘤細(xì)胞周期靜止現(xiàn)象可能與cdk2和cyclin D1蛋白表達(dá)降低有密切的關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，AEG-1在宮頸鱗癌組織以及細(xì)胞中有較高的表達(dá)，該蛋白的高表達(dá)顯著影響了SiHa的周期，使其在G0/G1期比例顯著增加，該現(xiàn)象的分子機(jī)制可能與cyclin D1以及CDK2的表達(dá)下調(diào)有相關(guān)性。

4 參考文獻(xiàn)

1梁紫影，張兆祥.星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因-1(AEG-1)與腫瘤〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011;27(3):297-300.

2Li J，Zhang N，Song LB,etal．Astrocyte elevated gene-1 is a novel prognostic marker for breast cancer progression and overall patient survival〔J〕．Clin Cancer Res，2008;14(21)：3319-26.

3Emdad L, Lee SG, Su ZZ,etal. Astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) functions as an oncogene and regulates angiogenesis〔J〕. Proc Nat Acad Sci, 2009;106(50): 21300-5.

4Brown DM, Ruoslahti E. Metadherin, a cell surface protein in breast tumors that mediates lung metastasis〔J〕. Cancer Cell, 2004; 5(4): 365-74.

5Li J, Yang L, Song L,etal. Astrocyte elevated gene-1 is a proliferation promoter in breast cancer via suppressing transcriptional factor FOXO1〔J〕. Oncogene, 2009; 28(36): 3188-96.

6崔曉峰，劉愛(ài)軍，韋立新，等．細(xì)胞周期蛋白Gl在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義〔J〕．中華病理學(xué)雜志，2008;37(3)：165-8.