微生物多糖提取、分離和純化方法的技術(shù)策略

張紅兵 胡云霞 趙士豪 狄柯坪 韓 梅

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061)

多糖廣泛分布于高等植物、地衣、海藻、動(dòng)物和微生物中，具有提高免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性，針對(duì)一些常見(jiàn)的老年性急慢性疾病具有預(yù)防和治療作用。由于微生物具有繁殖能力強(qiáng)、周期短、成本低、易控制的特點(diǎn)，所以普遍采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)多糖，其產(chǎn)量及質(zhì)量穩(wěn)步提高，性?xún)r(jià)比也優(yōu)于動(dòng)植物來(lái)源的多糖。目前，在食品工業(yè)中，微生物多糖已作為膠凝劑、成膜劑、保鮮劑、乳化劑等添加劑，廣泛應(yīng)用于老年保健食品，還有一些微生物胞外多糖及其衍生物具有重要的藥用價(jià)值，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中受到青睞。

典型的多糖生產(chǎn)工藝流程有如下四個(gè)方面〔1〕：①預(yù)處理：包括取樣、樣本儲(chǔ)存、樣本的清洗和樣本的均質(zhì)(其中均質(zhì)很重要，因?yàn)槲⑸镌谏L(zhǎng)過(guò)程中呈膜狀或絮狀，不利于后續(xù)工藝，均質(zhì)可以使樣本細(xì)胞充分分散)；②從預(yù)處理后的樣品中提取多糖；③多糖的純化；④多糖的分析鑒定。在上述流程中，微生物多糖的提取和純化是多糖研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，也是工藝的核心內(nèi)容，一般根據(jù)樣本特性制訂相應(yīng)的提取方法。本文將對(duì)有關(guān)提取及純化新技術(shù)成果進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

1 多糖提取方法的選擇

能夠產(chǎn)生多糖的微生物包括某些細(xì)菌、真菌(包括大型食用真菌)和藍(lán)藻類(lèi)，這些多糖主要以三種形式存在：一是黏附在細(xì)胞表面；二是分泌于胞外基質(zhì)；三是構(gòu)成細(xì)胞成分。因此，提取多糖的方法需根據(jù)不同存在形式進(jìn)行選擇。對(duì)于可溶性的多糖，尤其是胞外多糖，常采用離心法；而對(duì)于結(jié)合性多糖，則可以綜合多種不同的提取方法。

理想的多糖提取方法首先應(yīng)該是效率高，盡量避免造成樣本細(xì)胞的裂解(提取胞內(nèi)多糖除外)，盡可能不破壞多糖結(jié)構(gòu)〔2〕。在實(shí)際工作中，常綜合表1中列舉的數(shù)種方法，從多糖提取率和雜質(zhì)含量的高低兩方面進(jìn)行評(píng)判和選擇。

提取率的大小測(cè)定比較簡(jiǎn)單，而多糖質(zhì)量的判定多年在學(xué)術(shù)界存在一些困惑。早年的一些學(xué)者〔3〕根據(jù)多糖中蛋白和核酸的含量來(lái)評(píng)價(jià)多糖提取時(shí)細(xì)胞的裂解狀況。然而，近年來(lái)的研究認(rèn)為這種方法并不科學(xué)，因?yàn)椴糠侄嗵欠肿颖旧砭团c蛋白連接，所以蛋白含量?jī)H可參考，而多糖結(jié)構(gòu)中幾乎不含核酸成分，如果提取的多糖中含有大量核酸，則表明提取過(guò)程中發(fā)生了嚴(yán)重的細(xì)胞裂解。另外，胞內(nèi)物質(zhì)三磷酸腺苷和酶類(lèi)(如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，也常作為細(xì)胞裂解標(biāo)志物〔2〕，通過(guò)紫外可見(jiàn)光譜法測(cè)量這些物質(zhì)含量，可推斷所提取多糖的質(zhì)量。

化學(xué)提取法利用添加的化學(xué)物質(zhì)破壞多糖和細(xì)胞間的結(jié)合力，可加速多糖溶出。比較不同化學(xué)方法(CER，HCHO / NaOH，EDTA，戊二醛和堿)提取多糖效率結(jié)果顯示〔4〕：CER法總粗糖提取率(158±3) mg/g和HCHO/NaOH法的提取率(150±3)mg/g接近。而堿液提取法總粗糖(其中含有大量的水溶性蛋白質(zhì)等雜質(zhì))提取率比CER法高3倍左右〔5〕，但會(huì)造成多糖鏈的斷裂破壞，還會(huì)因細(xì)胞裂解導(dǎo)致產(chǎn)物的污染。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH>9時(shí)，NaOH造成多糖鏈斷裂，隨著pH增加，糖蛋白中的二硫鍵會(huì)斷裂，糖醛酸會(huì)水解等。上述變化可以用凝膠滲透色譜法或高效液相排阻色譜法進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估〔2〕。EDTA法盡管有較高的提取量，細(xì)胞裂解程度也低，但殘余的EDTA會(huì)污染多糖提取物〔6〕(雖然目前可以用透析法部分去除EDTA)。至于HCHO/NaOH方法，HCHO會(huì)導(dǎo)致多糖變性，影響碳水化合物結(jié)果的判定〔7，8〕。使用水解酶的方法提取多糖是種溫和而有效的方法，但目前提取效率還不太高〔9〕，加之成本高，限制其使用。目前，CER法具有高效率和細(xì)胞低裂解率，后續(xù)工藝中樹(shù)脂也容易去除，還避免了化學(xué)試劑的引入造成多糖污染，利于后續(xù)的多糖分析而廣泛受到青睞，成為普遍接受的多糖提取法。

物理提取方法包括超聲波處理、離心、微波處理及加熱等形式，這些方法基本都是利用外力促使多糖從細(xì)胞中分離出來(lái)并溶解到溶液中達(dá)到分離目的，其效率通常比化學(xué)法效率低得多。Comte等〔10〕比較了8種提取方法對(duì)提取效率的影響，即四種化學(xué)方法：CER、EDTA、HCHO/NaOH和戊二醛；二種物理方法：超聲波處理、加熱；一種綜合方法：CER + 超聲波處理；用離心法對(duì)照。結(jié)果表明：EDTA、HCHO/NaOH和戊二醛等三種化學(xué)方法的提取效率(96～318 mg/g)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CER、超聲波處理、超聲波處理 + CER、加熱等方法(21～64 mg/g)；對(duì)照方法效率則最低(僅為16～21 mg/g)。其中，CER方法比加熱法略高，前者僅比后者效率高1.1～1.6倍〔4〕。物理提取法與化學(xué)提取法相比有一些優(yōu)勢(shì)，它僅使多糖分子斷裂，引起多糖分子量大小分布的變化，而不會(huì)引入其他化學(xué)物，故不影響多糖的高效液相排阻色譜圖譜指紋，有利于對(duì)多糖成分和結(jié)構(gòu)的分析〔11〕。

目前，許多學(xué)者更傾向于選用綜合方法，即不同方法的有機(jī)組合，通常采用超聲波輔助其他物理和化學(xué)方法進(jìn)行提取多糖的工藝參數(shù)的優(yōu)化。優(yōu)化參數(shù)包括提取溫度、提取時(shí)間、溶液的pH值、溶劑的種類(lèi)等〔12，13〕。郭霞等〔14〕采用復(fù)合酶超聲波法對(duì)桑黃菌絲體多糖提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)提取溫度50℃、pH4.8、料液比1∶80、復(fù)合酶酶量5%、酶解60 min，提取率可達(dá)6.11%，如果再結(jié)合超聲破碎20 min，多糖提取率可達(dá)8.576%，分別是熱水提取法、復(fù)合酶法和超聲波法等簡(jiǎn)單提取法提取率的2.7倍、1.4倍和1.6倍。

目前，從多糖提取效果來(lái)看，還不存在一種通用于所有微生物的萬(wàn)能提取法，只能根據(jù)不同樣本特征進(jìn)行方法選擇和優(yōu)化，即將幾種提取方案加以比較，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，不斷修改，直到獲得較滿(mǎn)意效果為止。

2 多糖的分離和純化方法

上述提取物濃縮后加沉淀劑(如乙醇)過(guò)夜后離心，沉淀部分再經(jīng)乙醇分級(jí)或超濾分離后，冷凍干燥得到粗多糖。此粗多糖常含有蛋白質(zhì)、色素、低聚糖、氨基酸等雜質(zhì)，不僅影響產(chǎn)品的外觀性狀，而且有些大分子物質(zhì)可能對(duì)人體有害(如致敏因子等)，在純化時(shí)應(yīng)先除去，也就是對(duì)多糖純化前先進(jìn)行分離，然后再進(jìn)一步純化制備純度較高或相對(duì)單一的多糖。

2.1多糖的分離 實(shí)驗(yàn)室中常采用蛋白質(zhì)變性劑、鹽析、透析等方法，也有的實(shí)驗(yàn)室采用層析(包括離子交換層析和親和層析)、凝膠過(guò)濾、超濾和電泳法等較先進(jìn)的方法。見(jiàn)表2。

表1 微生物多糖提取方法和簡(jiǎn)明原理

表2 微生物多糖分離方法和簡(jiǎn)明原理

在實(shí)際操作中，如果采用化學(xué)方法除去雜質(zhì)，應(yīng)該注意反應(yīng)過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生熔解熱，應(yīng)給予降溫措施，防止多糖降解；還應(yīng)該考慮到化學(xué)試劑對(duì)目標(biāo)物質(zhì)造成不同程度損失和破壞，所以操作不易劇烈，而且應(yīng)盡量避免使用次數(shù)過(guò)多。實(shí)驗(yàn)室中常用 sevag法除去蛋白，二乙氨基乙基纖維素(DEAE Cellulose)柱層析除去色素，透析法和超濾法除去小分子雜質(zhì)〔15〕。

2.2多糖的純化和分級(jí) 提取液除去色素、單糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)后的多糖仍是多糖混合物，需進(jìn)一步分離純化為單一多糖，才能完成多糖分級(jí)。最常用方法是利用多糖在乙醇中溶解度差異進(jìn)行分級(jí)沉淀分離。也可根據(jù)多糖電荷密度不同，用季銨鹽絡(luò)合物、電泳、色譜(包括陰、陽(yáng)離子交換色譜，瓊脂糖或葡聚糖凝膠色譜和高效液相色譜)、層析方法進(jìn)行純化分級(jí)，也可根據(jù)多糖分子量大小利用凝膠過(guò)濾色譜、超濾等技術(shù)進(jìn)行分級(jí)，見(jiàn)表3。

表3 微生物多糖純化分級(jí)方法和簡(jiǎn)明原理

利用30%～50%乙醇沉淀法純化多糖，此時(shí)效率最高，但仍然要注意和多糖的損失和斷裂破壞，而季銨鹽只能與酸性多糖結(jié)合，需要注意調(diào)整溶液pH值，季銨鹽濃度控制在100～1 000 g/L之間較為適宜。

隨著分析化學(xué)技術(shù)的提高，目前純化多糖等活性物質(zhì)更傾向于利用層析法，包括按分子量大小和形狀分離的凝膠柱層析、按多糖極性大小分離的離子交換柱層析和按配體性質(zhì)分離的親和層析。前兩者需要采用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液為純水、各種濃度的鹽溶液及緩沖液，其離子強(qiáng)度依實(shí)驗(yàn)樣本和分離目標(biāo)確定。隨著親和技術(shù)發(fā)展，親和層析分級(jí)法逐步成為研究熱點(diǎn)，它具有高度特異性，甚至相同分子量大小的α-葡聚糖(吸附部分)和β-葡聚糖(非吸附部分)都可以區(qū)分開(kāi)來(lái)，這是其他方法難以比擬的。Sigma-Aldrich公司已開(kāi)發(fā)了多種含有配體的填料，不同配體與不同的多糖具有親和特異性。如：L2507和L5147兩者用于純化與氧(-O)相連的糖蛋白及含有α-D-半乳糖的糖蛋白；L8775的特異性是直接與末端為α-D-甘露糖殘基的糖復(fù)合物非還原端相連接；L4018具有與末端為α-D-甘露糖殘基和α-D葡萄糖基殘基的多糖親和性，用于分離凝膠過(guò)濾層析分離后仍然結(jié)合在一起的α-和β-葡聚糖〔16〕。至于高效液相色譜(HPLC)法，其機(jī)制與層析法相似。

3 小 結(jié)

多糖的提取和純化從傳統(tǒng)的溶劑萃取法、乙醇分級(jí)法，到酶法、超聲輔助法和微波輔助法及層析、超濾和電泳技術(shù)綜合運(yùn)用，使多糖提取效率和質(zhì)量都有所提高，但同時(shí)提取條件的要求越來(lái)越苛刻，儀器成本和提取成本也逐步增加。對(duì)于不同用途的多糖，要根據(jù)其原料的來(lái)源、現(xiàn)具備的條件、多糖使用目的，采用切實(shí)可行的提取方法和預(yù)處理方法。為了達(dá)到最好提取效果，可以將數(shù)種提取方法配合起來(lái)使用，以獲得較佳結(jié)果。

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