DcR3在預(yù)防博萊霉素大鼠模型發(fā)生肺纖維化中的作用

楊 洋 任 錦 劉 晶 馬忠森

(天津市胸科醫(yī)院，天津 130051)

肺纖維化一般指在毒物、自發(fā)免疫反應(yīng)、藥物副反應(yīng)、感染、嚴(yán)重的外傷等不同因素刺激下引起肺部炎癥反應(yīng)，肺泡持續(xù)性損傷、細(xì)胞外基質(zhì)反復(fù)破壞、修復(fù)、重建并過(guò)度沉積，導(dǎo)致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失的一類(lèi)疾病，發(fā)病率逐年升高。肺纖維化的發(fā)生通常經(jīng)歷肺泡炎和肺纖維化形成兩個(gè)階段，如果炎癥階段得到有效的抑制，勢(shì)必延緩或阻止肺纖維化的形成。但現(xiàn)有的抗炎藥物不能阻止肺纖維化的發(fā)展，有的甚至在抗炎的同時(shí)反而加重了肺纖維化的程度 。而近年來(lái)，DcR3在抗炎方面的研究備受關(guān)注，DcR3可能成為一個(gè)連接炎癥、 固有免疫、 腫瘤的中間點(diǎn)〔1〕。本文將采用DcR3蛋白尾靜脈注射干預(yù)肺纖維化早期動(dòng)物模型，觀察其對(duì)炎癥反應(yīng)的作用及其在預(yù)防纖維化方面的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性健康Wistar大鼠72只，平均體重250～300 g，購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，隨機(jī)分為三組，每組24只，分別為博萊霉素組、博萊霉素+ DcR3組、正常對(duì)照組。博萊霉素(日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn))；DcR3蛋白(Sigma 美國(guó))；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自晶美生物公司；OligodT、禽成髓細(xì)胞增生疾病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；TRIZOL、焦碳酸二乙酯(DEPC)、氯仿、異丙醇、dNTP、Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的制作與分組 以3%戊巴比妥鈉(0.4 ml/100 g體重)腹腔內(nèi)注射麻醉，博萊霉素溶液(1.375 mg/ml)按5 mg/kg經(jīng)氣管呈45°角注入大鼠肺內(nèi)，左右來(lái)回旋轉(zhuǎn)并按摩雙肺10余次，使藥液盡可能在雙肺內(nèi)均勻分布，手術(shù)后置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)喂養(yǎng)，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)記號(hào)分組。同樣方法，正常對(duì)照組推注等容積的生理鹽水。正常對(duì)照組大鼠活潑好動(dòng)，體格隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)更加肥碩，皮毛光澤發(fā)亮，呼吸平穩(wěn)。博萊霉素組造模后3 d開(kāi)始出現(xiàn)動(dòng)作緩慢、呼吸急促、進(jìn)食少；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)精神萎靡、喜蜷縮、體重明顯下降、皮毛色澤晦暗無(wú)光，死亡率較高。博萊霉素+DcR3組大鼠在造模后3～7 d也出現(xiàn)動(dòng)作緩慢、呼吸急促，進(jìn)食少但隨著注射DcR3，情況改善，2 w后活動(dòng)明顯增多、進(jìn)食恢復(fù)、呼吸恢復(fù)，體重逐漸增長(zhǎng)，4 w后與正常對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別。正常對(duì)照組：自模型制作當(dāng)天開(kāi)始每天給予尾靜脈注射1 ml生理鹽水；博萊霉素組：自模型制作當(dāng)天開(kāi)始每天給予尾靜脈注射1 ml生理鹽水；博萊霉素+ DcR3組：自造模當(dāng)天開(kāi)始按3.33 μg /kg 給予DcR3蛋白(1 μg/μl)1 ml，1次/d，尾靜脈注射，給藥時(shí)間2 w。

1.2.2標(biāo)本制備 各組分別于2、4、6、8 w處死大鼠6只：大鼠稱(chēng)重后以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，結(jié)扎左支氣管，分4次共注入磷酸鹽緩沖液(PBS) 6 ml邊按摩胸部邊回收液體，離心1 500 r/min 10 min，收集上清凍存待檢測(cè)TNF-α；重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)并立即用于RT-PCR檢測(cè)TNF-α mRNA的表達(dá)。取左肺組織凍存留作羥脯氨酸檢測(cè)；取右肺組織浸入10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋、切片以備用組織染色。

1.2.3肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù) 用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到離心管中，將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：統(tǒng)計(jì)4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的4個(gè)大格(每個(gè)大格含有16個(gè)中格)中的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4肺泡灌洗液中TNF-α mRNA及上清中含量的檢測(cè) 將重懸后BALF細(xì)胞轉(zhuǎn)移EP管中離心，去上清加入1 ml Trizol，提取RNA，測(cè)定RNA濃度：加99 μl三蒸水混勻稀釋?zhuān)绹?guó)惠普可見(jiàn)/紫外光光度儀比色測(cè)OD值，A260/280在1.8～2.0之間?？俁NA濃度(μg/ml)=OD 260×40×稀釋倍數(shù)。選取比值在2.0左右的RNA樣本做逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：1 μl DEPC水、1 μl引物加入10 μl模板RNA→稍離心，100℃沸水1 min→加入2 μl dNTP Mix、4 μl 5×buffer、2 μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶→稍離心，42℃水浴90 min→沸水3 min 滅活A(yù)MV→-20℃保存或立即PCR。PCR反應(yīng)體系：在0.3 ml PCR管，依次加入下列試劑：cDNA 5 μl、上游引物(10 pmol/L)1.5 μl、下游引物(10 pmol/L)1.5 μl、dNTP(2 mmol/L) 4 μl、10×PCR緩沖液5 μl Taq酶(2 U/μl)0.3 μl、ddH2O 32.7 μl，使總體積達(dá)50 μl→輕輕混勻、稍離心→設(shè)定PCR程序：94℃45 s，58℃45 s，72℃ 1 min，72℃延伸8 min，30個(gè)循環(huán)。引物：TNF-α(1 480 bp) 上游引物 5′-acagaaagcatgattccgaga-3′，下游引物 5′-tcagtagacagaagagcgtgg-3′；β-actin (570 bp) 上游引物 5′- acggcattgtcaccaactg -3′，下游引物5′- gcagctcatagctcttctc-3′。采用Tannon GIS凝膠電泳圖像分析儀進(jìn)行密度掃描、結(jié)果分析、計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。收集各組不同時(shí)期肺泡灌洗液上清，-20℃凍存，統(tǒng)一采用晶美的ELISA試劑盒，按照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)TNF-α含量。

1.2.5組織標(biāo)本染色 取石蠟切片，60℃烤2 h，二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水后，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色、Masson三聯(lián)染色。觀察肺組織病理學(xué)改變。參照Szapiel〔2〕方法確定肺泡炎和肺纖維化程度。即將肺泡炎分為4級(jí)：①無(wú)肺泡炎(-) 0分；②輕度肺泡炎(+)1分：?jiǎn)魏思?xì)胞浸潤(rùn)使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常；③中度肺泡炎() 2分：受累面積占全肺的20%～50%近胸膜部較重；④重度肺泡炎() 3分：面積>50%，偶見(jiàn)肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞及出血造成的實(shí)變。肺纖維化同樣進(jìn)行評(píng)分：①無(wú)肺纖維化(-) 0分；②輕度肺纖維化(+) 1分：受累面積<20%；③中度肺纖維化() 2分：受累面積20%～50%；(4)重度肺纖維化() 3分：受累面積>50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。

1.2.6羥脯氨酸含量測(cè)定 肺組織加0.8 ml冰冷的PBS進(jìn)行研磨，然后用0.2 ml預(yù)冷的PBS沖洗玻璃研磨管，一并倒入玻璃試管中。然后用南京建成羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(堿水解法)檢測(cè)羥脯氨酸含量。羥脯氨酸含量(μg/ml)=(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管含量(5 μg/ml)×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1肺組織大體形態(tài)及組織病理變化 (1)正常對(duì)照組：各時(shí)相點(diǎn)肺組織均呈粉紅色，表面光滑均勻，無(wú)出血水腫等病理改變。肺泡炎的程度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。(2)博萊霉素組：肺泡炎的程度在2 w時(shí)表現(xiàn)最重，有明顯的充血、水腫、出血點(diǎn)增多、部分融合成片；4 w時(shí)可見(jiàn)局部陳舊性出血點(diǎn)，肺表面不光滑，雙肺體積可縮小、蒼白，出現(xiàn)小結(jié)節(jié)，肺硬度增加；6 w時(shí)雙肺體積縮小，表面布滿結(jié)節(jié)，肺臟較硬，雙肺周邊可見(jiàn)致密的灰白或黃褐色纖維組織，近中央部分病變較輕，僅有輕度異常；2～6 w時(shí)炎癥程度均高于對(duì)照組(均P<0.05)，8 w時(shí)雙肺較6 w無(wú)明顯改變。(3)博萊霉素+DcR3組：2 w時(shí)可見(jiàn)充血水腫、出血點(diǎn)；4 w時(shí)雙肺顏色粉紅，個(gè)別雙肺周邊可見(jiàn)白色結(jié)節(jié)；6 w時(shí)雙肺較軟，顏色粉紅，僅在雙肺周邊見(jiàn)少量散在結(jié)節(jié)；8 w時(shí)雙肺改變基本同6 w。博萊霉素+DcR3組肺泡炎的程度表現(xiàn)為逐漸減輕的過(guò)程，2～6 w時(shí)炎癥程度均低于博萊霉素組(均P<0.05)，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；8 w時(shí)三組炎癥嚴(yán)重程度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

對(duì)照組肺纖維化程度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化；博萊霉素組肺纖維化程度逐漸加重，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較均具有顯著性差異(P<0.05)；博萊霉素+DcR3組肺纖維化程度無(wú)明顯加重趨勢(shì)，4～8 w時(shí)與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，2～4 w肺纖維程度與博萊霉素組無(wú)明顯差異(P>0.05)，6～8 w肺纖維程度與博萊霉素組比較有顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.2不同實(shí)驗(yàn)組、不同時(shí)期BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化 對(duì)照組BALF細(xì)胞總數(shù)波動(dòng)在6～7×106/ml；博萊霉素組高于對(duì)照組，尤其在2～4 w細(xì)胞總數(shù)差異顯著(P<0.01)，6～8 w與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；博萊霉素+DcR3組BALF細(xì)胞總數(shù)在2 w時(shí)最高，此后下降明顯，到第8周時(shí)反而低于對(duì)照組(P<0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，與博萊霉素組在2、4、8 w時(shí)比較均有顯著性差異(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3肺泡灌洗液中TNF-α表達(dá)量的變化 分別收集三組2、4 w肺泡灌洗液中的細(xì)胞(4 w后灌洗液細(xì)胞相對(duì)較少，提取RNA成功率低，故取消)，RT-PCR半定量分析TNF-α mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞有微量TNF-α mRNA表達(dá)；博萊霉素組表達(dá)量明顯升高，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)；博萊霉素+DcR3組細(xì)胞有少量TNF-α mRNA表達(dá)，2 w時(shí)與對(duì)照組和博萊霉素組比較有顯著性差異(P<0.01)，4 w時(shí)與博萊霉素組比較仍有顯著性差異(P<0.01)，但與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1。肺泡灌洗液上清中TNF-α蛋白含量的檢查結(jié)果顯示：對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α僅有微量表達(dá)；博萊霉素組該細(xì)胞因子的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組(P<0.01)，TNF-α的表達(dá)水平逐漸下降，至第8周與對(duì)照組和博萊霉素+DcR3組已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，博萊霉素+DcR3組二者的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，與博萊霉素組比較有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 病理切片肺泡炎程度評(píng)分結(jié)果

表2 病理切片纖維化程度評(píng)分及BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖1 TNF-α RT-PCR電泳結(jié)果

2.4肺組織切片染色結(jié)果 正常對(duì)照組：光鏡觀察可見(jiàn)大鼠肺結(jié)構(gòu)清晰，各觀察點(diǎn)均未出現(xiàn)明顯改變，Masson染色未見(jiàn)綠色膠原沉積。博萊霉素組：6 w時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡壁增厚，成纖維細(xì)胞大量增多，肺間質(zhì)纖維化瘢痕形成，毛細(xì)血管腔閉塞，Masson染色可見(jiàn)肺泡間隔內(nèi)有大量綠色膠原沉積；8 w時(shí)改變基本同6 w，Masson染色可見(jiàn)大量綠色膠原沉積。博萊霉素+DcR3組：6 w時(shí)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)綠色膠原沉積，較4 w無(wú)增多趨勢(shì)；8 w時(shí)改變基本同6 w，可見(jiàn)大部分正常肺泡結(jié)構(gòu)。

2.5肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定 對(duì)照組有微量羥脯氨酸表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)含量無(wú)明顯變化；博萊霉素組羥脯氨酸含量逐漸升高，6 w時(shí)達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)；博萊霉素+DcR3組羥脯氨酸含量在4～8 w時(shí)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，與博萊霉素組比較有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 BALF上清中TNF-α含量的檢測(cè)

表4 肺組織中羥脯氨酸含量的測(cè)定

3 討 論

DcR3又稱(chēng)TR6，為1998年P(guān)itti等〔3〕發(fā)現(xiàn)的一種可溶性TNF受體(TNFR)超家族成員，可與Fas、HVEM、DR3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其相應(yīng)配體FasL、LIGHT及TL1A，抑制細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、死亡以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，與多種疾病等密切相關(guān)。DcR3基因定位于人類(lèi)第20號(hào)染色體長(zhǎng)臂，20q13.3。DcR3 mRNA序列全長(zhǎng)1 114 bp，含1個(gè)開(kāi)放讀碼框，編碼300個(gè)氨基酸，N末端前29個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，蛋白分子量約35 000 KD。DcR3肽鏈含4個(gè)串聯(lián)的富集半胱氨酸的重復(fù)序列，此為T(mén)NFR超家族的共同標(biāo)志，但DcR3缺乏明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，屬于分泌性蛋白，可用于靜脈注射。目前關(guān)于DcR3的研究主要集中在腫瘤、自身免疫性疾病、胰島移植等方面〔4，5〕，在肺纖維化的研究中較少，本研究提示其可能有一定的抗炎作用〔6〕。同時(shí)Wortinger等〔7〕建立FasL誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，預(yù)先用DcR3類(lèi)似物處理的小鼠較未經(jīng)處理的小鼠中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，支氣管肺灌洗液中的GM-CSF、MIP及KC等炎性介質(zhì)顯著降低。文獻(xiàn)〔8〕也報(bào)道，局部注射可以改善風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)活動(dòng)度，DcR3可以直接中和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊膜炎局部的炎癥和下調(diào)Th1T細(xì)胞的數(shù)目，抑制干擾素(IFN)-γ和白細(xì)胞介素(IL)-17或TNF-α表達(dá)。

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)〔9〕，肺纖維形成早期局部肺組織存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，各種促炎性物質(zhì)在肺組織局部聚集。參與的細(xì)胞因子和其他的介質(zhì)較多，且在不同階段所參與的細(xì)胞因子有所不同，TNF-α、IL-1、的表達(dá)高峰在炎癥期，此后逐漸減弱；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)1、IL-10在早期表達(dá)，在炎癥期形成高峰，此后仍維持高水平表達(dá)，本研究說(shuō)明DcR3的應(yīng)用的確抑制了博萊霉素致肺纖維化大鼠模型的炎癥反應(yīng)。

通常將肺纖維化的發(fā)生過(guò)程分為兩個(gè)階段，初始的肺泡炎階段即致病因素導(dǎo)致上皮損傷，上皮下基底膜破壞、炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞活化，分泌各種炎癥因子；肺纖維化階段：在第一階段炎癥因子的作用下，成纖維細(xì)胞募集、分化、增生，膠原和細(xì)胞基質(zhì)過(guò)度增生，肺纖維化形成。早期的炎癥因子TGF-β、TNF-α、IL-4、 IL-13以及 IFN-γ、IL-1β等的大量產(chǎn)生可激活體內(nèi)一系列細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，如ERK-MAPK信號(hào)通路，其在啟動(dòng)分子信號(hào)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖方面非常重要〔10，11〕。此外，JNK-、p38-以及Smad等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均具有促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化的作用，這些通路均在炎癥因子的刺激下活化從而促進(jìn)肺纖維的發(fā)生〔12〕。 可見(jiàn)阻止炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大化，抑制某些關(guān)鍵細(xì)胞因子的釋放理論上可以預(yù)防肺纖維化的發(fā)生。

本研究通過(guò)延長(zhǎng)觀察時(shí)間發(fā)現(xiàn)，早期注射DcR3組的大鼠其肺纖維化程度明顯減輕，甚至局限化，大鼠一般生活狀態(tài)明顯恢復(fù)，這提示DcR3早期的抗炎作用可能在一定程度上預(yù)防了肺纖維化的發(fā)生，但DcR3在肺纖維的形成是否存在直接作用，尚需要進(jìn)一步研究。

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