腸道清潔對T-RFLP分析潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜菌群多樣性的影響*

冉文斌 歐陽欽 史 維 孫曉濱 王 瓊

四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科1(610041) 成都市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科2

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種以反復(fù)發(fā)作的腹痛、黏液膿血便等為主要臨床表現(xiàn)的慢性非特異性腸道炎性疾病，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。近年來，腸道微生物在UC發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注。有研究[1]發(fā)現(xiàn)，UC患者存在腸道菌群失調(diào)，其腸道細(xì)菌的構(gòu)成和分布與正常人群具有顯著差異。目前，微生物指紋圖譜技術(shù)、高通量測序技術(shù)等多種檢測微生物系統(tǒng)多樣性的技術(shù)已廣泛應(yīng)用于UC的相關(guān)研究中[2]。末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)分析是一種分析生物群落的指紋技術(shù)，可對生物群體的特定基因進(jìn)行定性和定量測定，具有重復(fù)性、穩(wěn)定性以及敏感性高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于菌種的鑒定、分類、衛(wèi)生監(jiān)測、法醫(yī)物證等領(lǐng)域[3-5]。既往應(yīng)用T-RFLP檢測腸道黏膜菌群多樣性的研究中，采集腸黏膜前通常需行腸道清潔準(zhǔn)備，而清潔劑多為滲透性電解質(zhì)，可改變黏膜表面細(xì)菌構(gòu)成，從而使結(jié)果產(chǎn)生偏倚。本研究以UC患者為研究對象，采用T-RFLP技術(shù)對接受和未接受腸道清潔的腸黏膜標(biāo)本的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，旨在了解腸道清潔對T-RFLP分析UC患者腸黏膜菌群多樣性的影響。

對象與方法

一、研究對象

納入2010年9月～2012年11月四川大學(xué)華西醫(yī)院收治的UC患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考“對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見”[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 過去2個月內(nèi)未曾使用抗菌藥物、益生菌或相關(guān)抗菌中藥；②年齡18～65歲，且UC于18歲后發(fā)??；③排除UC活動期伴明顯感染征象者；④排除合并嚴(yán)重肝、腎、肺等重要臟器功能衰竭或糖尿病、肥胖等代謝性疾病以及其他原因不能完成結(jié)腸鏡檢查者。根據(jù)結(jié)腸鏡檢查前是否行腸道清潔，將患者分為洗腸組和未洗腸組。根據(jù)Baron內(nèi)鏡評分標(biāo)準(zhǔn)，自定義評分≥2分為內(nèi)鏡下活動，≤1分為內(nèi)鏡下緩解。所有入選患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. 標(biāo)本采集和保存：結(jié)腸鏡下取直腸、乙狀結(jié)腸交界處腸黏膜組織，置于液氮暫存，24 h內(nèi)轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱待測。

2. T-RFLP檢測：以20 mg/mL 90 μL溶菌酶[研域(上海)化學(xué)試劑有限公司]作用于腸黏膜標(biāo)本30 min，1 000×g離心3 s，采用DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，按照試劑盒說明書提取DNA，采用細(xì)菌通用引物27F-1492R對提取的DNA行特異性擴(kuò)增，熒光標(biāo)記上游引物27F。引物堿基序列27F：5’-FAM-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’； 1492R：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(美國Omega公司)提純擴(kuò)增產(chǎn)物，分別使用限制性內(nèi)切酶MspⅠ、HaeⅢ(Fermentas公司)于37 ℃恒溫水箱中對純化產(chǎn)物避光酶切 4 h，然后將產(chǎn)物置于80 ℃恒溫水箱中失活內(nèi)切酶 20 min，1 000×g離心3 s，低溫保存送北京擎科生物有限公司，以3730XL型基因測序儀(Applied Biosystems公司)檢測目標(biāo)片段長度和熒光強(qiáng)度。

3. 數(shù)據(jù)采集和分析：采用Genemarker V1.4軟件進(jìn)行圖像數(shù)字信息轉(zhuǎn)換，以50熒光單位為熒光強(qiáng)度記錄底線值，記錄30～600 bp末端限制片段(T-RF)的信息。定義物種豐度(S)為操作分類單元(OTU)的個數(shù)，即T-RFLP圖譜中波峰個數(shù)[7]；定義同一組樣本中，在50%以上的樣本中出現(xiàn)的波峰為優(yōu)勢峰，對應(yīng)片段長度為優(yōu)勢T-RF。用曲線下面積比值(AUC)表示每個OTU的峰下面積比值，進(jìn)行相對定量分析，AUC(%)=單個T-RF峰面積/總峰面積×100%。采用Bio-DAP軟件計算物種多樣性指數(shù)，包括Shannon-Wiener指數(shù)(H’)、Simpson指數(shù)(D)、均勻度指數(shù)(E)，其中H’=ΣPilnPi(Pi為某個峰的峰高占總峰高的比例，Pi=Ni，Ni為某個峰的峰面積)，D=1-ΣPi2，E=H/lnS。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

共38例患者入選。洗腸組18例，其中男10例，女8例，年齡22～47歲，平均(35.2±9.7)歲；未洗腸組20例，其中男10例，女10例，年齡23～51歲，平均(33.4±12.2)歲。洗腸組中內(nèi)鏡下活動12例，內(nèi)鏡下緩解6例；未洗腸組中內(nèi)鏡下活動15例，內(nèi)鏡下緩解5例。兩組患者性別、年齡、疾病活動度構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、聚類分析

根據(jù)不同T-RF的相對含量構(gòu)成比對兩組樣本進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明洗腸組與未洗腸組間聚類交叉明顯，未能將兩組分入不同子聚類(見圖1)，提示兩組菌落構(gòu)成成分相似。

UC-Y：洗腸者；UC-N：未洗腸者

三、腸道菌群多樣性比較

1. 豐度：洗腸組、未洗腸組經(jīng)MspⅠ、HaeⅢ、MspⅠ+HaeⅢ酶切所得的OTU數(shù)量相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(21.2±11.7對18.7±9.0；15.0±11.3對15.6±9.7；36.2±17.4對34.3±12.6)(P>0.05)。

2. 物種多樣性指數(shù)：未洗腸組Shannon-Wiener指數(shù)較洗腸組顯著增高(2.40±0.45對2.01±0.39,P=0.042)；洗腸組、未洗腸組Simpson指數(shù)、均勻度指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.21±0.06對0.23±0.14；0.82±0.05對0.74±0.21)(P>0.05)。

3. 優(yōu)勢T-RF及其相對含量：在MspⅠ酶切結(jié)果中，未洗腸組優(yōu)勢T-RF為35、66、74、94、141、221、227、281、311、486、490 bp；洗腸組優(yōu)勢T-RF為35、37、66、74、94、141、221、227、311、486、490 bp；281 bp為未洗腸組特有優(yōu)勢T-RF，37 bp為洗腸組特有優(yōu)勢T-RF；HaeⅢ酶切結(jié)果與之相似。對兩組共有優(yōu)勢T-RF的AUC比較顯示，洗腸組490 bp T-RF的AUC顯著高于未洗腸組，其余優(yōu)勢T-RF的AUC在兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

討 論

人類消化系統(tǒng)中的細(xì)菌數(shù)量達(dá)1013～1014cfu，從胃至遠(yuǎn)端結(jié)腸逐漸增多，以結(jié)腸的密度最大，約400～500種，主要為專性厭氧菌。細(xì)菌在腸腔中除自上而下垂直分布的差異外，腸腔內(nèi)、腸上皮外黏液層表面、黏液層內(nèi)部、腸上皮表面的細(xì)菌分布亦存在差異[8-9]。McGuckin等[10]的研究指出，結(jié)腸腸腔中含有大量厭氧菌，黏液層內(nèi)部偏外側(cè)700 μm處主要由變性黏液、低濃度抗菌肽以及少量細(xì)菌構(gòu)成，內(nèi)側(cè)100 μm處主要由黏附牢靠的黏液、高濃度抗菌肽以及極少量細(xì)菌或無菌狀態(tài)構(gòu)成，更內(nèi)層的結(jié)腸隱窩則完全無菌，由大量黏液、產(chǎn)生抗菌肽的上皮細(xì)胞以及潛在活性的白細(xì)胞等構(gòu)成。因此，研究結(jié)腸黏膜菌群的理想標(biāo)本應(yīng)于內(nèi)鏡下直接采集結(jié)腸組織，而不進(jìn)行腸道清潔，以免對黏膜菌群的構(gòu)成產(chǎn)生影響，造成研究結(jié)果偏倚。

聚類分析常用于樣本數(shù)量和種類眾多的生物多樣性研究，根據(jù)樣本間的相似度，將其分為相對同質(zhì)的組群，分析結(jié)果較傳統(tǒng)分類方法更細(xì)致、全面、合理。本研究對UC洗腸組和未洗腸組進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示兩組樣本間聚類交叉明顯，未能將兩組分入不同子聚類，提示洗腸組與未洗腸組間腸道細(xì)菌種類總體構(gòu)成相似，無明顯差異。

表1 洗腸組、未洗腸組優(yōu)勢T-RF相對含量比較M(Q1, Q3)

除聚類分析外，Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、均勻度指數(shù)亦可反映不同群落中的微生物多樣性，其中均勻度指數(shù)反映一個群落中全部物種個體數(shù)目分配的均勻程度， Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)能夠同時反映豐度和均勻度，但前者易受罕見種類影響，后者對優(yōu)勢種類改變較為敏感[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，洗腸組與未洗腸組的菌群多樣性在豐度方面無明顯差異；未洗腸組Shannon-Wiener指數(shù)明顯高于洗腸組，兩組間Simpson指數(shù)和均勻度指數(shù)均無明顯差異，提示洗腸組和未洗腸組菌群種類的總數(shù)量和優(yōu)勢種類數(shù)量無明顯差異，但未洗腸組罕見細(xì)菌的種類增加。進(jìn)一步對優(yōu)勢T-RF及其相對含量的比較證實，洗腸組和未洗腸組間總體細(xì)菌種類無明顯差異，個別種類存在顯著差異，但具體細(xì)菌種類尚不能明確。

綜上所述，腸道清潔對T-RFLP技術(shù)研究腸黏膜菌群結(jié)果無明顯影響，但可造成腸黏膜部分罕見菌群減少，然而由于T-RFLP方法的局限，尚不能明確該細(xì)菌的種類，有待后續(xù)應(yīng)用更多的限制性內(nèi)切酶，并增加樣本量進(jìn)行研究。

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