耐萬(wàn)古霉素腸球菌耐藥表型檢測(cè)和基因型分析

張俠家，沈繼錄，賈偉華

耐萬(wàn)古霉素腸球菌耐藥表型檢測(cè)和基因型分析

張俠家1，2，沈繼錄1，2，賈偉華3

目的 研究某院耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRE）的耐藥特性、基因型及流行情況。方法 采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn);使用E-test法檢測(cè)VRE對(duì)萬(wàn)古霉素的最低抑菌濃度（MIC），PCR法檢測(cè)萬(wàn)古霉素的耐藥基因，BLAST法對(duì)6株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析其氨基酸序列。結(jié)果 193株腸球菌中檢出6株萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌;該菌株對(duì)高單位慶大霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、紅霉素、利福平、替考拉寧均耐藥，對(duì)呋喃妥因和利奈唑胺均敏感，對(duì)萬(wàn)古霉素的MIC值均＞256 mg/L;基因型均為vanA;6株菌的vanA基因均有氨基酸發(fā)生了改變，其中5株菌均發(fā)生第83位氨基酸突變，由天冬酰胺（AAC）→天冬氨酸（GAC）。結(jié)論 我院VRE多為多重耐藥，給臨床治療VRE感染帶來(lái)困難，醫(yī)院應(yīng)加強(qiáng)預(yù)防監(jiān)測(cè)，阻止其在院內(nèi)的傳播和流行。

萬(wàn)古霉素;耐藥性;腸球菌;表型;基因型

腸球菌屬可導(dǎo)致尿路感染、皮膚軟組織感染，甚至?xí)鹞＜吧母骨桓腥?、敗血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎。近年來(lái)，腸球菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，耐藥水平也迅速上升［1］。隨著 1988年英國(guó)首次報(bào)道［2－3］了耐萬(wàn)古霉素腸球菌（vancomycin-resistantEnterococci，VRE），世界各地陸續(xù)有VRE被發(fā)現(xiàn)，并且世界各國(guó)VER檢出率非常高，近年我國(guó)許多地區(qū)VRE也有一定檢出率［4］?，F(xiàn)對(duì)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年分離到的6株VRE進(jìn)行分析，為臨床治療VRE用藥、控制院內(nèi)傳播及進(jìn)行流行病調(diào)查提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年1月～12月臨床分離的193株腸球菌 （剔除來(lái)自同一患者的重復(fù)株），其中糞腸球菌59例，屎腸球菌131例，鳥(niǎo)腸球菌3例。

1.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 25923和糞腸球菌ATCC 29212均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.3 主要儀器設(shè)備 MicroScan WalkAWay-96plus全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)西門(mén)子公司;電泳儀（天能ESP 300）購(gòu)自上海天能公司;PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Biometra公司;凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 培養(yǎng)基和試劑 M-H瓊脂培養(yǎng)基為英國(guó)OXOID公司商品;PCR檢測(cè)試劑Ex Taq酶、Ex Taq Buffer及dNTPs均為日本TaKaRa公司商品。

1.5 抗菌藥物 高單位慶大霉素（120 μg）、氨芐西林、環(huán)丙沙星、氯霉素、磷霉素、紅霉素、利福平、呋喃妥因、利奈唑胺、替考拉寧、萬(wàn)古霉素11種藥物紙片均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司;E-test紙條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判斷依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）文件2011版標(biāo)準(zhǔn)。紙片法萬(wàn)古霉素耐藥菌株再采用E-test紙條確認(rèn)最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC）。耐藥株選擇標(biāo)準(zhǔn):E-test紙條測(cè)定對(duì)萬(wàn)古霉素的MIC ＞256 mg/L。

1.7 PCR 引物 引物依據(jù)參考文獻(xiàn)［5－6］進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。見(jiàn)表1。

1.8 腸球菌萬(wàn)古霉素耐藥基因檢測(cè) 應(yīng)用PCR對(duì)van耐藥的菌株進(jìn)行耐藥基因的擴(kuò)增，包括:vanA、vanB 、vanC1和 vanC2－3型基因;PCR 反應(yīng)條件與過(guò)程如下:挑取純培養(yǎng)菌落置入去離子水中配制成懸液，100℃煮沸10 min，8 000 r/min離心5 min，上清液即為模板液。PCR反應(yīng)體積為50 μl，包括4 μl的模板液，上下游引物各 2 μl（10 μmol/L），4 μl dNTPs（200 μmol/L），0.25 μl Ex Taq 酶（1.6 U），5 μl Ex Taq Buffer，去離子水 32.8 μl。擴(kuò)增條件:預(yù)變性93℃ 2 min;變性93℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸2 min，停止4℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，取出用BIO-RAD顯像，拍照觀察結(jié)果。

1.9 PCR產(chǎn)物測(cè)序分析 PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生物工程公司測(cè)序。以屎腸球菌（taxid:1352）為陽(yáng)性對(duì)照，將測(cè)序結(jié)果在GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因同源性分析（BLAST）。

表1 van基因PCR引物序列及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 6 株耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌（vancomycin-resistantEnterococci Faecium，VREFm）藥敏試驗(yàn) K-B紙片法測(cè)定6株VREFm對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率，結(jié)果顯示VREFm對(duì)高單位慶大霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、氯霉素、紅霉素、利福平100%耐藥;對(duì)磷霉素耐藥性呈現(xiàn)出差異;對(duì)呋喃妥因和利奈唑胺均敏感，對(duì)替考拉寧耐藥。見(jiàn)表2。

2.2 6 株VREFm基因檢測(cè) 6株耐藥屎腸球菌經(jīng)PCR擴(kuò)增后均為vanA陽(yáng)性基因，片段783 bp。未檢測(cè)出vanB、vanC1和 vanC2-3型基因。見(jiàn)圖1。

2.3 6 株P(guān)CR產(chǎn)物基因測(cè)序 從vanA基因表達(dá)陽(yáng)性菌株中，進(jìn)行vavA基因的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)6株菌vanA基因均有氨基酸的突變，其中5株菌均發(fā)生第83位氨基酸突變Asn（AAC）→Asp（GAC），見(jiàn)表3。

3 討論

萬(wàn)古霉素是治療革蘭陽(yáng)性菌感染的一種重要的糖肽類(lèi)抗生素，被認(rèn)為是治療嚴(yán)重腸球菌感染的“最后一道防線”。然而近年來(lái)，隨著萬(wàn)古霉素在臨床應(yīng)用治療腸球菌感染逐漸增多，使得VRE感染率迅速增加［7］，給臨床治療帶來(lái)了困難。本研究對(duì)我院2011年分離的193株腸球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果篩選出6株VRE，耐藥率占3.1%，低于國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道［2，8］，并且藥敏試驗(yàn)顯示6株 VRE 全部是屎腸球菌。屎腸球菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥的耐藥率高于糞腸球菌，并且屎腸球菌對(duì)大多數(shù)抗生素天然耐藥，提示屎腸球菌耐藥形勢(shì)比糞腸球菌嚴(yán)峻［9］，使臨床治療VRE感染更加棘手。

圖1 vanA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

表2 6株VREFm對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率（%）

表3 6株VREFm的vanA基因氨基酸突變情況

目前，VRE耐藥表型和基因型均可分為vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM 和 vanN 9型［10］，其中vanA型為主要類(lèi)型，對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧均耐藥，其次為vanB型，表現(xiàn)為對(duì)萬(wàn)古霉素不同程度耐藥而對(duì)替考拉寧敏感，vanC型對(duì)萬(wàn)古霉素敏感而對(duì)替考拉寧耐藥。我院檢出的6株VRE基因型均是vanA型，并且6株菌vanA基因均有氨基酸的突變，其中5株菌均發(fā)生第83位氨基酸突變Asn（AAC）→Asp（GAC）。6株vanA基因表達(dá)陽(yáng)性菌株，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥，其編碼基因發(fā)生突變可能導(dǎo)致其編碼的蛋白高表達(dá)，從而導(dǎo)致對(duì)萬(wàn)古霉素MIC的進(jìn)一步提升，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。vanA是腸球菌中最常見(jiàn)的耐糖肽類(lèi)抗菌藥物的耐藥型，也是迄今為止唯一一個(gè)能在金黃色葡萄球菌中檢出的耐藥類(lèi)型;vanA型耐藥基因可由質(zhì)粒介導(dǎo)傳遞給金黃色葡萄球菌，產(chǎn)生耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA）。VRSA的毒力和侵襲力更大，使目前存在的抗菌藥物面臨極大挑戰(zhàn)。因此，要規(guī)范化使用抗菌藥物，要不斷完善實(shí)驗(yàn)室對(duì)VRE的檢測(cè)，做到快速分離和鑒定，如果發(fā)現(xiàn)有VRE應(yīng)及時(shí)與醫(yī)院有關(guān)部門(mén)取得聯(lián)系，做好消毒隔離工作，定期檢測(cè)醫(yī)院耐藥菌株對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況，防止VRE在醫(yī)院內(nèi)的交叉感染和傳播。

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Detection of phenotype and analysis of genotype in vancomycin-resistantEnterococci

Zhang Xiajia1，2，Shen Jilu1，2，Jia Weihua3
（1Dept of Clinical Laboratory Diagnostics，3The First Clinical College，Anhui Medical University，Hefei230032;2Dept of Medical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

ObjectiveTo research the resistant characteristics，genotype and prevalence of vancomycin-resistantEnterococci（VRE）.MethodsK-B disc diffusion method was used to determine the susceptibility，minimum inhibitory concentration（MIC）for vancomycin of VRE was detected by E-test method;VRE was then subjected to PCR for resistance related genes;6 strains sequencing results of PCR product were contrastively analyzed the amino acid sequence by BLAST.Results6 VREFm strains were found from 193 strains enterococci;6 VREFm strains were completely resistant to high unit gentamicin，ampicillin，ciprofloxacin，teicoplanin，but were sensitive to linezolid and macrodantin，MIC for vancomycin was more than 256 mg/L;Genotypes were vanA;Amino acids in vanA gene have changed with Asn83→Asp（AAC→GAC）.ConclusionVRE in our hospital is mostly multi-drug resistant，

which bringS difficulty in clinical treatment for its infection.So the hospital should strengthen the prevention and monitoring，to prevent the spread of VRE strains in the hospital and popular.

vancomycin;drug resistance;enterococci;phenotype;genotype

R 378.1;R 446.5;R 453.2

A

1000－1492（2014）05－0662－03

2014－02－17接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào):81171618）

安徽醫(yī)科大學(xué)1臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室、3第一臨床學(xué)院，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230022

張俠家，女，碩士研究生;

沈繼錄，男，博士，副主任技師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:shenjilu@126.com