納米傳感器對卵巢癌患者呼氣的分析研究

張 偉，石大友，陶 麗，花慶嶺，杜瀛瀛，張 靜，莊亞麗，劉 虎

納米傳感器對卵巢癌患者呼氣的分析研究

張 偉1*，石大友1*，陶 麗2，花慶嶺1，杜瀛瀛1，張 靜3，莊亞麗3，劉 虎1

目的 探討利用納米傳感器（亦稱納米鼻）氣體識別技術(shù)篩查卵巢癌（OC）的可行性。方法 收集48例OC患者和48例健康對照者的呼氣標(biāo)本，利用納米傳感器對以上兩組受試者呼氣標(biāo)本進行氣體指紋圖譜的分析，通過判別因子分析（DFA）模式進行鑒別區(qū)分。結(jié)果 OC患者和健康對照者之間達(dá)到良好的區(qū)分（89%的準(zhǔn)確度）;早期OC患者與健康對照者之間達(dá)到75%的準(zhǔn)確度。結(jié)論 納米傳感器呼氣分析技術(shù)作為一種非侵入性的篩查方法，對于OC的早期診斷具有潛在的應(yīng)用價值。

卵巢癌;氣體指紋圖譜;納米傳感器

*對本文具有同等貢獻

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，因其發(fā)病隱匿以及缺乏有效的篩查工具，其病死率居婦科惡性腫瘤之首［1］。目前常規(guī)的OC腫瘤指標(biāo)CA12-5以及超聲、CT等輔助檢查往往因為缺乏特異性、價格昂貴等不適合腫瘤的早期篩查。人體呼出的氣體中含有200多種揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）。呼氣分析通過分析人體呼氣成分及含量的改變，從而反映出人體內(nèi)病理生理的改變［2］，具有安全、快捷和無創(chuàng)等優(yōu)點，已被應(yīng)用于疾病的輔助診斷。本課題組前期利用氣相色譜－質(zhì)譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)在肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和OC早期篩查方面均顯示出良好的應(yīng)用價值［3］。該研究擬采用納米傳感器技術(shù)對OC患者及健康對照者的呼氣標(biāo)本進行分析。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2012年3月～8月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、合肥市婦幼保健醫(yī)院OC患者呼氣樣本48例，年齡30～70（51.38±11.32）歲，其中上皮來源OC 40例，惡性生殖細(xì)胞來源OC 2例以及交界性來源OC 6例;早期OC患者25例［（50.54±11.29）歲］，晚期OC患者22例［（53.18±11.80）歲］，1例分期不明。OC患者均為初診初治，并隨訪術(shù)后病理證實，無肺部疾病以及腫瘤病史，無糖尿病高血壓、自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡）。另選同期健康女性呼氣樣本48例（對照組），年齡36～69（49.59±9.02）歲。對照組為患者家屬和醫(yī)院職工，均經(jīng)體檢證實身體健康，均排除煙酒不良嗜好和妊娠可能。

1.2 主要儀器 3L-Tedlar?采樣袋購自大連德霖氣體包裝有限公司;99.999%氮氣購自合肥眾儀有限公司;標(biāo)準(zhǔn)空氣玻璃轉(zhuǎn)子流量計購自常州雙環(huán)熱工儀表有限公司;包含9個傳感器（6個金納米傳感器和3個碳納米管傳感器）的納米傳感器為以色列理工學(xué)院研制;ORBOTM420 Tenax?TA吸附管以及tube cutter購自美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 氣體采集 3L-Tedlar?采樣袋使用前用99.999%的氮氣清洗3次，以除去袋中的殘留吸附物。囑受試者夜間禁食，晨起在通風(fēng)良好環(huán)境下深吸氣后向采樣袋中呼氣，直至袋子吹滿為止，同時采集患者周圍的空氣作為對照。

1.3.2 氣體的吸附 利用tube cutter將Tenax?TA吸附管兩端打開，再利用鐵氟龍?zhí)坠軐⑽焦軆啥朔謩e與采樣袋及標(biāo)準(zhǔn)空氣玻璃轉(zhuǎn)子流量計連接，將采樣袋中的氣體標(biāo)本按照200 ml/min的流速濃縮到吸附管中，蓋好兩端密封蓋。

1.3.3 氣體分析 進行標(biāo)本分析前，將納米傳感器的進樣口真空處理5 min，再進行5 min的氣體分析，再次進行真空處理，重復(fù)3～5次，以測試儀器的重復(fù)性。分析過程通過數(shù)據(jù)記錄裝置（2701型數(shù)字多用表）記錄整個過程中傳感器電阻的變化。記錄的范圍至少持續(xù)2個循環(huán)。整個系統(tǒng)操作過程由自定義的LabVIEW電腦程序控制。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究采用判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA）作為統(tǒng)計模式識別算法。DFA的輸出變量（即典型變量）通過在相互正交的維度得到第一典型變量（the first canonical variable，CV1），通過CV1值的統(tǒng)計處理從而有效地降低了多維的實驗數(shù)據(jù)，最終將各組間的樣本區(qū)分開來。本研究取各組70%的樣本作為訓(xùn)練集建立DFA診斷模型，30%樣本作為隨機盲法測試集，驗證DFA診斷模型。通過刀切法（亦稱留一法）交叉驗證真陽性（true positive，TP）、真陰性（true negative，TN）、假陽性（false positive，F(xiàn)P）和假陰性（false negative，F(xiàn)N）的預(yù)測數(shù)來評價分類是否成功。由于早期OC患者例數(shù)較少，因此對于早期OC與健康對照者之間DFA模型的驗證采用K折交叉驗證法。本研究使用MATLAB?（The MathWorks公司）軟件進行模式識別和數(shù)據(jù)分類。

2 結(jié)果

2.1 OC與健康對照者間的鑒別 通過對48例OC患者與48例健康對照者的標(biāo)本進行分析，取其中68份OC和健康對照者的呼氣標(biāo)本（各組70%的樣本）建立 DFA模型，結(jié)果表明其準(zhǔn)確度達(dá)到90%，敏感性、特異性分別為88%、91%，再對余下28例呼氣標(biāo)本（各組30%的樣本）作為驗證集，通過留一法交叉驗證，結(jié)果顯示對OC診斷的準(zhǔn)確度達(dá)89%，敏感性和特異性分別為79%、100%。見圖1、2 和表1。

圖1 DFA模型用于卵巢癌和健康對照訓(xùn)練集樣本和盲法驗證集樣本的分類

圖2 訓(xùn)練集樣本的受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic，ROC）

2.2 早期OC與健康對照者間的鑒別 對于25例早期OC和48例健康對照者間的鑒別中，通過采用DFA模型分析，鑒別的準(zhǔn)確度達(dá)到82%，敏感性、特異性均為82%，由于早期OC例數(shù)較少，因此通過K折交叉進行驗證，驗證后結(jié)果顯示，其準(zhǔn)確性、靈敏度和特異度分別為75%、76%和75%。見圖3、4和表1。

圖3 DFA模型用于區(qū)分早期OC患者和健康對照者

圖4 ROC用于區(qū)分早期OC患者和健康對照者

3 討論

OC的5年生存率與分期密切相關(guān)，Ⅰ期OC 5年生存率約85%，而Ⅳ期僅為4%。故早期診斷是減少OC病死率和預(yù)后的關(guān)鍵所在。然而對于早期OC，往往無特異性癥狀，常規(guī)的OC腫瘤指標(biāo)CA12-5特異性差，部分良性腫瘤及子宮內(nèi)膜異位癥等疾病均可出現(xiàn)陽性［4］，超聲、CT等輔助檢查往往因為缺乏特異性、價格昂貴等，不適合早期篩查。隨著分子代謝組學(xué)的研究進展，新興的代謝組學(xué)開辟了腫瘤早期診斷、療效評價及預(yù)后判斷的新思路。代謝組學(xué)是一種將圖像識別方法和生物信息學(xué)結(jié)合起來的分析技術(shù)，用于檢測體液或組織中的代謝產(chǎn)物并分析其變化規(guī)律。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展伴隨著機體代謝產(chǎn)物的變化，代謝組學(xué)能對腫瘤引起的機體代謝變化做出整體評價，篩選出有價值的生物標(biāo)志物，用于腫瘤的早期診斷［5］。

表1 基于納米傳感器鑒別的DFA模型分類統(tǒng)計結(jié)果（%）

目前認(rèn)為癌變過程常伴隨有氧化應(yīng)激的增強，產(chǎn)生過多的氧自由基，其作用于細(xì)胞膜上的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸導(dǎo)致VOCs的產(chǎn)生。呼氣分析作為一種簡便、快捷、無創(chuàng)的檢測方法，通過對腫瘤異常代謝所產(chǎn)生的VOCs的含量和成分進行分析，從而達(dá)到對腫瘤的早期鑒別和診斷［6］。然而由于呼氣中的VOCs濃度較低且成分復(fù)雜，因此對呼氣檢測的儀器要求很高。本課題組前期利用固相微萃取聯(lián)合GC-MS技術(shù)，在肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌以及OC中均篩查出特異性腫瘤標(biāo)志物［3］。本研究采用納米傳感器對OC患者及健康對照者呼氣進行分析，相對于GC-MS，納米傳感器具有以下優(yōu)勢:不需要對樣本進行除濕以及預(yù)富集處理;分析快速;檢測的靈敏度高;分析數(shù)據(jù)前不必對數(shù)據(jù)進行選擇就可以將各測試組區(qū)分開;并且不受性別、年齡及吸煙等因素影響［7］。其核心部分是金納米顆粒的碳基感應(yīng)器，當(dāng)氣體通過納米顆粒傳感器時，呼氣中的顆粒就會積聚在碳層中，感應(yīng)器膨脹推動金納米顆粒相互接近，引起傳感器電阻變化。而每種顆粒均具有獨特的阻抗效應(yīng)，每一個金納米顆粒都可以反映一系列的VOCs，所有傳感器的電阻變化均被同時記錄下來，每種VOCs對應(yīng)一個金納米顆粒的電阻變化，最低檢測范圍為1～5 ppb，通過主成分分析對金納米顆粒記錄的電阻變化進行篩查，從而篩選出最能概括出檢測標(biāo)本最具特征的因素作為主成分，建立診斷模型，從而與其他研究對象鑒別區(qū)分開來。國內(nèi)外有研究［8－10］報道利用納米傳感器技術(shù)對不同腫瘤之間的鑒別、胃良惡性潰瘍的鑒別診斷以及不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株的鑒別均取得了重要的結(jié)果。

本課題組前期利用GC-MS技術(shù)對OC患者進行呼氣分析，最終篩查出苯乙烯和壬醛兩種特異性標(biāo)志物［3］，其兩種物質(zhì)的濃度在OC患者和健康對照者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明OC患者同健康對照者相比，其機體異常代謝后的呼氣中存在有特異性的揮發(fā)性標(biāo)志物，即兩者呼出氣體的主成分存在差異。因此，在前期的研究基礎(chǔ)上，本研究采用納米傳感器技術(shù)，通過對受試者呼出氣體的主成分進行分析，結(jié)果表明可以將OC患者與健康對照者區(qū)分開來，通過交叉驗證后，其診斷的準(zhǔn)確度達(dá)到89%，特異性達(dá)到100%。另外本研究還進一步對早期OC患者與健康志愿者的呼氣進行分析，顯示納米傳感器同樣能夠?qū)⒍吆芎玫膮^(qū)分鑒別出來。本研究結(jié)果的意義在于:利用納米傳感器技術(shù)能夠?qū)⒃缙贠C患者從健康對照者中篩查出來，通過早期診斷、能夠提高OC患者的生存率，降低其死亡率。因此對于有BRCA1和BRCA2基因突變、肥胖及腫瘤家族史的高危人群進行篩查，可能從中受益。然而，需要指出的是，本研究僅僅是小樣本的探索性研究，對于OC患者尤其是早期患者的呼氣分析，仍然需要大樣本、多中心的實驗研究進行驗證。

（致謝:感謝以色列理工學(xué)院Hossam Haick教授和Haitham Amal博士的技術(shù)支持與幫助。）

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Analysis of ovarian cancer patients breath with nano-sensor technology

Zhang Wei1，Shi Dayou1，Tao Li2，et al
（1Dept of Oncology，2Dept of Gynecology and Obstetrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

ObjectiveTo investigate the feasibility of odor prints for discriminating the ovarian cancer patients with nanomaterial-based sensors.MethodsAlveolar exhaled breath samples were collected from 96 volunteers，na-nose were used to discriminate the odor prints from 48 patients with ovarian cancer（OC）and 48 healthy controls by loading discriminant factor analysis（DFA）pattern recognition.ResultsThe blind DFA models showed:An excellent discrimination between the ovarian cancer patients and the healthy controls（89%accuracy）;early stage versus healthy controls showed 75%accuracy.ConclusionThe primary results can lead for a new non-invasive promising screening method for diagnoses early of OC of early stages and thus lowering the mortality of OC.

ovarian cancer;odor prints;nano-sensor

R 737.31

A

1000－1492（2014）05－0669－04

2014－02－25接收

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科、2婦產(chǎn)科，合肥230022

3安徽醫(yī)科大學(xué)婦幼保健臨床學(xué)院（合肥市婦幼保健醫(yī)院）產(chǎn)科，合肥 230061

張 偉，男，碩士研究生;

劉 虎，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:drliuhu@gmail.com