Preparation of AChE/IL-GR/CHI/GCE Enzyme Electrode and Its Application for Chlorpyrifos Pesticide*

ZHENG Yingying，LIU Zhimin，LI Jie，ZHAN Haijun

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China)

Preparation of AChE/IL-GR/CHI/GCE Enzyme Electrode and Its Application for Chlorpyrifos Pesticide*

ZHENG Yingying，LIU Zhimin*，LI Jie，ZHAN Haijun

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China)

According to the special properties of functionalized ionic liquid modified graphene(IL-GR)，IL-GR was first immobilized on the glass carbon electrode via chitosan(CHI)cross-linking，F(xiàn)inally，acetylcholinesterase (AChE)can be immobilized on the composite film by adsorption.A novel biosensor for detecting organophosphorus pesticides enzyme biosensor(AChE/IL-GR/CHI/GCE)was developed and was used for the determination of chlorpyrifos.Different technologies were employed to study the construction process and the electrochemical properties of the biosensor.Linear relationship between the inhibition percentage(I%)and logarithm of concentration of chlorpyrifos was found in the range of 1.0×10－10mol/L～1.0×10－5mol/L，and the detection limit was calculated to be about 7.0×10－12mol/L(S/N=3).The recoveries of chlorpyrifos in vegetable were from 92.3%to 108.6%.Key words:enzyme electrode;graphene;ionic liquid;acetylcholinesterase;chlorpyrifos

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的農(nóng)藥被用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，其中有機(jī)磷(OPs)農(nóng)藥是目前使用最為廣泛的品種，其高毒性和高殘留性直接危害了人民健康。因此，建立快速、靈敏的OPs檢測(cè)方法顯得非常必要。近年來(lái)基于乙酰膽堿酯酶(AChE)的生物傳感器已在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面得到了很好的應(yīng)用，相對(duì)于傳統(tǒng)的氣相色譜和液相色譜法，生物傳感器具有簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用、可靠、靈敏等優(yōu)點(diǎn)［1－2］。

隨著納米科技的發(fā)展，將不同性能的納米材料如Ag［3］、Pt［4］等貴重金屬以及碳納米管［5］、ZrO［6］2，等引入生物傳感器已成為研究熱點(diǎn)。石墨烯(Graphene)是由sp2雜化碳原子構(gòu)成的二維蜂窩狀結(jié)構(gòu)的一種碳材料，具有比表面積大、導(dǎo)電性強(qiáng)及電催化性能好等優(yōu)點(diǎn)，目前已用作制備電化學(xué)傳感器的電極材料［7－8］。但石墨烯片與片之間有較強(qiáng)的范德華力，易團(tuán)聚，從而限制了它的廣泛應(yīng)用。因此，尋求一種既能有助于石墨烯分散又不影響其與基底電極快速電子交換的媒介是研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)離子液體對(duì)石墨烯間堆積作用具有屏蔽作用，可有效提高石墨烯的分散性［9］。本研究首先制備氨基功能化離子液體修飾石墨烯(IL-GR)，然后采用殼聚糖(CHI)分散IL-GR，制備玻碳修飾電極(ILGR/CHI/GCE)，利用其表面大量的氨基靜電吸附組裝AChE，制得新型OPs檢測(cè)酶電極(AChE/IL-GR/ CHI/GCE)，并用于卷心菜樣品中OPs的代表—毒死蜱的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Prestige－21傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津公司);UV－2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);Hitachi－800透射電子顯微鏡(日本日立公司);CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極;所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行，所有的電位均相對(duì)于SCE。

氯化乙酰膽堿(ATCl，Sigma);乙酰膽堿酯酶(AChE，C3389，236 U/mg，Sigma);殼聚糖(CHI，Sigma);毒死蜱(純度96.2%，北京北研馨綠生物技術(shù)有限公司);石墨粉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)由磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制而成。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 氨基功能化離子液體(IL-NH2)及功能化離子

液體修飾石墨烯(IL-GR)的制備

參照文獻(xiàn)［10］，N－甲基咪唑和3－溴丙胺鹽酸鹽以等摩爾比加入到無(wú)水乙醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流24 h，產(chǎn)物除去溶劑及未反應(yīng)物后用少量水將其溶解，加入KOH，調(diào)溶液pH值為10.0左右。所得溶液通過減壓蒸餾除去大部分水，用乙醇－四氫呋喃(體積比為1∶1)混合溶劑提取產(chǎn)物，收集濾液，最后真空干燥至恒重，即得黃色黏稠狀氨基功能化離子液體(IL-NH2)。

采取文獻(xiàn)方法合成石墨氧化物(GO)［11］，然后合成功能化離子液體修飾石墨烯(IL-GR)。具體如下:100 mL GO(1 mg/mL))分散液中加入0.35 g KOH和0.2 g IL-NH2，超聲均勻，然后80℃下回流24 h，最后加入0.3 mL的水合肼，80℃下再回流2 h。所得產(chǎn)物洗至中性，60℃干燥12 h，即得修飾石墨烯(IL-GR)。

1.3 AChE/IL-GR/CHIT/GCE修飾電極的制備

將CHI溶解在HAc溶液中，制得0.5%(w/v) CHI溶液，然后將2.0 mg的IL-GR加入到10 mL上述分散液中，超聲分散2 h后得到IL-GR/CHI分散液。

玻碳電極(GCE)依次用金相砂紙和Al2O3粉在麂皮上打磨并超聲清洗。將5 μL的IL-GR/CHI分散液滴加到電極表面，冰箱中放置12 h，然后滴加5 μL的AChE。過夜晾干即得乙酰膽堿酯酶電極，記為AChE/IL-GR/CHI/GCE，電極不用時(shí)置于4℃冰箱中保存.

1.4 檢測(cè)方法及抑制率計(jì)算

采用DPV法檢測(cè)毒死蜱。在含1.0 mmol/L ATCl(pH 8.0 PBS)溶液中，采用三電極系統(tǒng):修飾酶電極為工作電極，SCE為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極;在0.2 V～0.8 V之間進(jìn)行DPV掃描，記錄DPV曲線，確定原始響應(yīng)電流。然后將其置于不同濃度的毒死蜱溶液中浸泡12 min，相同條件下測(cè)定酶電極在底物ATCl中的響應(yīng)電流。

乙酰膽堿酯酶能夠催化底物氯化乙酰膽堿(ATCl)水解，催化活性受有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的抑制，導(dǎo)致水解產(chǎn)物濃度減小，故電流減小。農(nóng)藥的濃度越大，電流減小的越顯著，即對(duì)酶的抑制率增加。抑制率可由下式計(jì)算［12］:

抑制率(I%)=［(I0－I1)/I0］×100%

I0為ATCl在AChE/IL-GR/CHI/GCE上的響應(yīng)電流，I1是抑制后ATCl在AChE/IL-GR/CHI/GCE的響應(yīng)電流。

2 結(jié)果與討論

2.1 譜學(xué)表征

2.1.1 GO、GR和IL-GR的紅外及紫外表征

圖1(a)為GO、GR和IL-GR的紅外光譜圖。從圖中可看出，1071 cm－1和1370 cm－1的峰分別對(duì)應(yīng)C—O的伸縮振動(dòng)及C—O—H伸展峰，1725 cm－1處對(duì)應(yīng)C=O伸縮振動(dòng)，1622 cm－1處對(duì)應(yīng)于未被氧化的石墨的骨架振動(dòng)。經(jīng)水合肼還原后，上述特征峰基本消失，表明GO已轉(zhuǎn)變成了GR。IL-GR紅外譜圖中，新增加的2940 cm－1和2840 cm－1分別對(duì)應(yīng)CH3(N)以及CH2(N)的伸縮振動(dòng)吸收峰，而1164 cm－1歸屬于平面咪唑環(huán)的伸縮振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明IL-NH2已成功的接到石墨烯上［13］。

圖1(b)為GO、GR和IL-GR的紫外光譜圖。圖中顯示GO的最大吸收波長(zhǎng)在228 nm，而GR和ILGR的最大吸收波長(zhǎng)分別在270 nm和266 nm。上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致［14］。

圖1GO、GR和IL-GR的紅外光譜圖及紫外譜圖

2.1.2 IL-GR的電鏡表征

圖2為IL-GR的透射電鏡圖，從圖中可看出ILGR呈鱗片狀薄層結(jié)構(gòu)。

圖2IL-GR的透射電鏡圖

2.2 修飾電極的電化學(xué)表征

2.2.1 不同電極的循環(huán)伏安圖

不同電極在5.0 mmol/L K3Fe(CN)6(含有0.1 mol/L KCl)溶液中的循環(huán)伏安曲線如圖3所示。與裸玻碳電極(曲線a)相比，IL-GR/CHI/GCE修飾后的電極峰電流增大(曲線b)，這歸因于修飾石墨烯較大的比表面積和良好的導(dǎo)電性。然而，當(dāng)把酶AChE固定在IL-GR/CHI/GCE修飾的電極表面時(shí)，電流反而減小(曲線c)，這主要是因?yàn)槊阜肿硬痪哂袑?dǎo)電性，阻礙了界面電子轉(zhuǎn)移，同時(shí)也說(shuō)明AChE被成功地固定到電極表面。

2.2.2 AChE/IL-GR/CHI/GCE的動(dòng)力學(xué)研究

圖35 .0 mmol/L［Fe(CN)6］3－/4－在(a)GCE、(b)IL-GR/CHI/GCE和(c)AChE/IL-GR/CHI/GCE電極上的循環(huán)伏安行為

實(shí)驗(yàn)中通過循環(huán)伏安法考察了AChE/IL-GR/ CHI/GCE酶電極的掃描速度與峰電流之間的關(guān)系。結(jié)果表明，隨著掃速不斷增大，其氧化峰電流和還原峰電流均逐漸增大，在50 mV/s～200 mV/s，氧化峰電流(Ipa)以及還原峰電流(Ipc)與掃速的平方根(ν1/2)均呈良好的線性關(guān)系，線性方程為:Ipa=－455.78ν1/2－10.35(r=0.999);Ipc=495.20ν1/2+ 36.66(r=0.998)，說(shuō)明該電極上的氧化－還原反應(yīng)受擴(kuò)散控制［15］。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 pH的優(yōu)化

溶液的pH值決定固定AChE的生物活性，圖4顯示了pH值對(duì)1.0 mmol/L ATCl在AChE/IL-GR/ CHI/GCE上響應(yīng)電流的影響?？梢钥闯?，當(dāng)溶液的pH為6.5～8.0時(shí)，氧化電流隨pH的增大而增大，至pH為8.0時(shí)，響應(yīng)電流達(dá)到最大，過此，則氧化電流反而下降。本實(shí)驗(yàn)選擇pH為8.0，以獲得最大響應(yīng)電流。

圖4pH對(duì)酶電極響應(yīng)的影響

2.3.2 酶用量的優(yōu)化

酶的固定量影響生物電極的響應(yīng)信號(hào)。實(shí)驗(yàn)在含有1.0 mmol/L ATCl(pH 8.0 PBS)中考察了固定不同量的酶對(duì)響應(yīng)信號(hào)的影響。如圖5所示，當(dāng)酶固定量達(dá)到0.3 U時(shí)，響應(yīng)電流值達(dá)到最大。當(dāng)酶量再增加時(shí)，酶層變厚，阻礙了酶促反應(yīng)產(chǎn)物向電極表面的擴(kuò)散，降低了靈敏度。因此，實(shí)驗(yàn)選擇酶的固定量為0.3 U。

圖5 酶用量對(duì)酶電極響應(yīng)的影響

2.3.3 IL-GR用量的優(yōu)化

研究了IL-GR在CHI分散液中的用量對(duì)生物電極響應(yīng)電流的影響。如圖6所示，當(dāng)IL-GR的(mIL-GR∶VCHI)增加時(shí)，響應(yīng)電流逐漸增加;當(dāng)濃度達(dá)到0.15 mg/mL時(shí)，響應(yīng)電流最大;再增加用量，響應(yīng)電流開始降低。這也許是由于電極表面修飾層厚度過大，阻礙了酶促反應(yīng)產(chǎn)物硫代膽堿的傳質(zhì)以及與電極的電子交換。因此實(shí)驗(yàn)選擇IL-GR濃度為0.15 mg/mL。

圖6IL-GR復(fù)合物濃度對(duì)酶電極響應(yīng)的影響

2.3.4 抑制時(shí)間的選擇

毒死蜱對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用，隨著抑制時(shí)間的延長(zhǎng)，AChE的活性降低。實(shí)驗(yàn)中對(duì)抑制時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，如圖7結(jié)果表明，當(dāng)抑制時(shí)間小于12 min時(shí)，酶的相對(duì)活性隨抑制時(shí)間的延長(zhǎng)迅速降低，當(dāng)抑制時(shí)間大于12 min后，酶的抑制率趨向一個(gè)穩(wěn)定值，故本實(shí)驗(yàn)中抑制時(shí)間選擇為12 min。

圖7 農(nóng)藥的抑制率與作用時(shí)間的關(guān)系

2.4 毒死蜱的檢測(cè)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，AChE/IL-GR/CHI/GCE在不同濃度的毒死蜱溶液中的差分脈沖伏安圖如圖8(a)所示。由圖可看出，AChE/IL-GR/CHI/GCE電極在被毒死蜱農(nóng)藥抑制后，其在底物中的響應(yīng)電流減小。且農(nóng)藥的濃度越大，抑制作用越明顯，酶電極在底物中的響應(yīng)電流越小。以抑制率(I%)對(duì)毒死蜱濃度(c，mol/L)的負(fù)對(duì)數(shù)作圖，如圖8(b)所示，抑制率與毒死蜱濃度在1.0×10－10mol/L～1.0×10－5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為:I% =120.76+11.31lgc，相關(guān)系數(shù)為0.9875，檢出限為7.0×10－12mol/L(S/N=3)。

圖8電極在不同濃度毒死蜱溶液中的差分脈沖伏安圖(a)及AChE抑制率與毒死蜱濃度的負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系圖(b)

本文建立的酶電極與其他OPs檢測(cè)酶電極性能的比較結(jié)果見表1。結(jié)果表明，本法制備的酶電極對(duì)Ops檢測(cè)的線性范圍、檢測(cè)限及檢測(cè)時(shí)間優(yōu)于大部分報(bào)道的酶電極。較低的檢測(cè)限可能歸因于電極表面固定的修飾石墨烯(IL-GR)具有較大的比表面積，因此對(duì)Ops具有較強(qiáng)的選擇富集能力，從而大大降低了檢測(cè)限。而IL-GR良好的導(dǎo)電能力提高了電極表面電子的傳導(dǎo)速率，因此縮短了檢測(cè)時(shí)間。

表1 本方法酶電極與其他酶電極的性能對(duì)比

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

取10 g新鮮卷心菜菜葉，研碎后置于表面皿中，吸取100 μL 10－5mol/L毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液噴撒于菜葉上，加蓋放置10 h后用丙酮萃取樣品中的毒死蜱，過濾并轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中得到樣品溶液。樣品溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，回收率的范圍在92.3%～108.6%之間。結(jié)果表明該酶電極可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，并具有很好的效果。

2.6 電極制備的一致性和穩(wěn)定性

用相同方法制備的6根酶電極測(cè)定6份相同的農(nóng)藥樣品(5.0×10－8mol/L)，測(cè)得抑制率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(Relative Standard Deviation)為4.8%，表明酶電極的制作工藝具有較好的一致性。固定的酶活性在二周后仍能保持原來(lái)的93%，一個(gè)月后仍可保持88%，表明酶電極具有很好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

提出了一種基于功能化離子液體修飾石墨烯固定乙酰膽堿酯酶的新型生物電極，并將其用于農(nóng)藥毒死蜱的測(cè)定。此傳感界面能有效保持酶的活性，使酶電極具有良好的響應(yīng)性能。該電極制作簡(jiǎn)單，操作方便，為有機(jī)磷農(nóng)藥提供了新的檢測(cè)方法。

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鄭瑩瑩(1987－)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)殡娀瘜W(xué)生物傳感器，zhengyingying228@163.com;

劉志敏(1970－)，女，博士，教授，河南省教育廳學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人，河南省教育廳青年骨干教師，主要從事電化學(xué)及生物傳感器研究，zhimin@haut.edu.cn。

AChE/IL-GR/CHI/GCE結(jié)構(gòu)酶電極的研制及其對(duì)毒死蜱農(nóng)藥的檢測(cè)*

鄭瑩瑩，劉志敏*，李婕，展海軍
(河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，鄭州450001)

利用氨基功能化離子液體修飾石墨烯(IL-GR)的獨(dú)特性質(zhì)，以殼聚糖(CHI)為交聯(lián)劑，首先在玻碳電極表面固定IL-GR，然后吸附乙酰膽堿酯酶(AChE)制得新型有機(jī)磷檢測(cè)酶電極(AChE/IL-GR/CHI/GCE)，并用于卷心菜樣品中毒死蜱農(nóng)藥殘留的測(cè)定。采用透射電鏡(TEM)表征了IL-GR的形貌，采用循環(huán)伏安法(CV)和差示脈沖伏安法(DPV)研究了酶電極的電化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，抑制率(I%)與毒死蜱濃度的對(duì)數(shù)在1.0×10－10mol/L～1.0×10－5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為7.0×10－12mol/L(S/N=3)。測(cè)定了卷心菜中毒死蜱的含量，回收率為92.3%～108.6%。關(guān)鍵詞:酶電極;石墨烯;離子液體;乙酰膽堿酯酶;毒死蜱

TP212.2

A

1004－1699(2014)04－0426－06

2013－12－18修改日期:2014－03－19

C:7230J

10.3969/j.issn.1004－1699.2014.04.002

項(xiàng)目來(lái)源:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21275039);河南省高校青年骨干教師基金資助項(xiàng)目(001135)