具有ACC脫氨酶活性的絞股藍根際細菌的分離鑒定及其促生作用*

宋金秋，吾魯木汗·那孜爾別克，張 緹，恩特馬克·布拉提白

(吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000)

具有ACC脫氨酶活性的絞股藍根際細菌的分離鑒定及其促生作用*

宋金秋，吾魯木汗·那孜爾別克，張 緹，恩特馬克·布拉提白

(吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000)

為了篩選含ACC脫氨酶的根際促生細菌，以1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)為唯一氮源，從絞股藍根際土壤中富集和分離ACC脫氨酶陽性細菌，利用α-丁酮酸測定法和CAS平板法分別檢測其ACC脫氨酶活性和產(chǎn)嗜鐵素能力，利用菌液培養(yǎng)接種法檢測細菌的促生作用，最后通過生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析對所篩選的菌株進行鑒定.經(jīng)富集篩選法從絞股藍根際土壤中分離出9株ACC脫氨酶陽性細菌，它們均具有不同程度的ACC脫氨酶活性，其中3株細菌能產(chǎn)生嗜鐵素.促生試驗結(jié)果表明，7株ACC脫氨酶活性細菌對水稻幼苗根系的生長發(fā)育表現(xiàn)出不同程度的促生作用，其中菌株JDG127的促生作用最明顯，與對照組相比，水稻幼苗的根長和根鮮重增長了約1.6倍.鑒定結(jié)果表明，9株細菌中1株屬于單胞菌屬(Stenotrophomonas)，1株屬于類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)，1株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，2株屬于腸桿菌屬(Enterobacter)，4株屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)，與ACC脫氨酶相比，鐵載體對根際細菌的促生作用更明顯.

絞股藍；根際細菌；ACC脫氨酶；促生能力

植物根際促生細菌(plant growth promoting rhizobacteria)是生存在植物根際的一類能促進植物生長、防治植物病害、提高農(nóng)作物產(chǎn)量的有益細菌，它們通過直接或間接作用機制能促進或調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[1].文獻[2]中的綜述中闡述，植物根際土壤中廣泛存在多種植物根際促生細菌，目前已鑒定的菌株有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、固氮螺旋菌屬(Azospirillum)、固氮菌屬(Azotobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、黃單胞菌屬(Xanthornonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligens)、節(jié)桿菌屬(Arthobacter)、布克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)等.目前，國內(nèi)外通過使用化肥提高農(nóng)作物產(chǎn)量，用農(nóng)藥防治果樹和農(nóng)作物病害.隨著化肥和農(nóng)藥使用量的增加，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，對食品安全和人類健康造成嚴重的威脅.因此，研究根際促生細菌的促生作用和生化作用及其機制，對代替或減少農(nóng)藥和化肥的使用、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)、保持植物微生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性以及維護農(nóng)田生態(tài)平衡都有重要的意義.

乙烯的正常生理功能是協(xié)助打破種子休眠，促進植物的成熟和衰老，而植物一生大部分發(fā)育階段只需少量乙烯，當植物在生長發(fā)育階段如遇到高鹽、干旱、水澇、重金屬污染、機械損害、病原體侵入等不良環(huán)境因素時會產(chǎn)生大量乙烯作為植物對環(huán)境的一種生理應(yīng)急反應(yīng)，稱為“逆境乙烯”.逆境乙烯的產(chǎn)生從某種意義上來說是植物的一種自我保護反應(yīng)，但是乙烯過量產(chǎn)生將導(dǎo)致植物生長發(fā)育受阻或死亡，過量乙烯還會抑制根的伸長、側(cè)根的生長以及根毛的形成.文獻[3]中的研究表明，根際促生細菌可產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙胺-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)脫氨酶，該酶是通過催化乙烯的直接前體ACC分解成α-丁酮酸和胺來降低植物體內(nèi)的乙烯含量，保持植物體內(nèi)外乙烯的平衡，從而減少過量乙烯對植物生長發(fā)育造成的不良影響.文獻[4]報道了從遼寧東濱海濕地植物翅堿蓬根際土壤中分離到4株ACC脫氨酶活性細菌，并在鹽脅迫條件下檢測它們對燕麥初生苗的促生作用，結(jié)果顯示這4株菌在質(zhì)量濃度為10 g/L NaCl鹽脅迫下也均表現(xiàn)出顯著的促生作用.文獻[5]報道了將陰溝腸桿菌UW的ACC脫氨酶基因acds克隆到廣泛宿主范圍表達載體pRK415的多克隆位點上，將重組質(zhì)粒pRKACC分別轉(zhuǎn)化固氮螺菌Cd和Sp245并檢測它們的促生作用，結(jié)果顯示與固氮螺菌Cd和Sp245相比，重組菌Cd/pRKACC和Sp245/pRKACC都能促進番茄和油菜幼苗的生長.文獻[6]報道了從草莓、小麥等農(nóng)作物根際土壤中分離到6株ACC脫氨酶活性細菌，其中菌株ACC30的酶活性最高，平皿促生試驗結(jié)果顯示，用該菌株處理紫花苜蓿種子后根伸長的長度明顯大于對照組CK和Baccillus subtilus處理組.目前，有關(guān)具有ACC脫氨酶活性的絞股藍根際細菌的分離鑒定及其促生作用研究國內(nèi)外未見報道.筆者采用富集篩選法從湖南省吉首市德夯國家級重點風景名勝區(qū)絞股藍根土壤中篩選到9株具有ACC脫氨酶活性的細菌，通過菌液培養(yǎng)接種法檢測它們對水稻幼苗的促生作用.

1 材料與方法

1.1材料

ACC購自上海瀚鴻化工科技有限公司；α-丁酮酸購自美國Sigma公司；PCR試劑和DNA marker購自大連寶生物工程公司；鉻天青S購自上海生工生物工程公司；按照文獻[7]中的方法分別配制PAF，DF，ADF和TSB培養(yǎng)基，用于含ACC脫氨酶根際細菌的篩選及其ACC脫氨酶酶活性的檢測；按照文獻[8]中的方法配制CAS培養(yǎng)基，用于檢測細菌產(chǎn)生嗜鐵素能力；T優(yōu)300水稻種子購自湖南隆平種業(yè)有限公司.

1.2方法

1.2.1根際細菌的分離及純化 細菌初選工作于2012年3—5月進行.采集湖南省吉首市德夯國家級重點風景名勝區(qū)絞股藍根及其粘附土壤(≤ 2 mm區(qū)域)，置于冰盒(溫度約4 ℃)，立即帶回實驗室.取植物根部，用無菌水沖洗，以去除外圍土壤，切成長約1 cm小段，石蠟油封住兩端，加入10 mL PBS溶液，150 r/min震蕩處理30 min，梯度稀釋后，分別取100 μL菌液涂布于TSB固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h.取15株形態(tài)各異的細菌，供下一步工作.

1.2.2 ACC脫氨酶陽性細菌的篩選 將上述15株菌株分別接種于10 mL的PAF液體培養(yǎng)基，28 ℃震蕩培養(yǎng)48 h，用新鮮ADF培養(yǎng)基將菌液稀釋至10-5倍，取100 μL菌液涂布于ADF固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，挑取單菌落接種于新鮮ADF固體培養(yǎng)基，通過重復(fù)轉(zhuǎn)接篩選得到能在以ACC為唯一氮源的ADF培養(yǎng)基上生長的菌株.將菌株接種于10 mL的TBS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加入體積分數(shù)為20%的甘油，-80 ℃凍存.

1.2.3 根際細菌ACC脫氨酶酶活性的測定 用0.1 mol/L Tris-HCl (pH值為8.5)緩沖液配制100 mmol/L的α-丁酮酸保存液,經(jīng)梯度稀釋配制終濃度0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mmol/L的α-丁酮酸溶液,各取200 μL加入300 μL 0.2%的2,4-二硝基苯肼,30 ℃孵育30 min,加2 mL的2 mol/L NaOH溶液顯色苯腙,540 nm測定吸光度.以α-丁酮酸的濃度(mmol/L)為橫坐標,以吸光率(A540)為縱坐標繪制標準曲線.將-80 ℃保存的菌株接種于15 mL的TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,8 000 r/min離心10 min收集菌體,用5 mL的DF液體培養(yǎng)基洗滌菌體后懸浮于7.5 mL ADF液體培養(yǎng)中,28 ℃培養(yǎng)24 h,使細菌誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶.參照文獻[9]中的方法測定ACC脫氨酶的活性,即將誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶的菌液,8 000 r/min離心10 min收集菌體,用0.1 mol/L Tris-HCl (pH值為7.6)緩沖液洗滌,將菌體重懸于600 μL的0.1 mol/LTris-HCl (pH值為8.5)緩沖液,加30 μL甲苯提取細胞液,取200 μL細胞提取液與20 μL的0.5 mol/L ACC溶液混合,30 ℃孵育15 min,加300 μL 0.2%的2,4-二硝基苯肼,30 ℃孵育30 min,加2 mL濃渡為2 mol/L的NaOH溶液顯色苯腙,540 nm測吸光率.以牛血清蛋白為標準,采用Bradford法測定細胞提取液中的總蛋白質(zhì)含量.將每分鐘形成1 μmol α-丁酮酸的量定義為1個酶活力單位.

1.2.4 根際細菌產(chǎn)嗜鐵素能力的檢測 用CAS平板檢測法[8]測定根際細菌的產(chǎn)嗜鐵素能力，即將活化后的菌株接種于CAS檢測平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察平板上黃綠色透明圈的產(chǎn)生和大小，如菌落周邊有黃綠色暈圈產(chǎn)生，即表明該菌株具產(chǎn)嗜鐵素能力.

1.2.5 根際細菌對水稻初生苗的促生作用 參照文獻[10]報道的菌液培養(yǎng)接種法檢測ACC脫氨酶活性菌株對水稻的促生作用，即挑取飽滿無病害的水稻種子進行表面消毒，消毒后立即用無菌水充分洗滌，并將ACC脫氨酶活性菌株、大腸桿菌DH5α分別配制成108CFU/mL的菌懸液.將消毒洗凈后的種子置于培養(yǎng)皿中(每皿30粒種子，每個種子重復(fù)處理3次)，培養(yǎng)皿底部分別放有7 mL的ACC脫氨酶活性菌株菌懸液、大腸桿菌DH5α菌懸液、無菌水濕潤的濾紙，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后測定根長及其鮮重.

1.2.6 根際細菌的生理生化鑒定 根據(jù)絞股藍根際ACC脫氨酶活性細菌的菌落形態(tài)特征、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色性狀，有關(guān)生理生化鑒別試驗參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行屬和種的鑒定.

1.2.7 根際細菌16S rRNA序列分析 用改良的CTAB法提取細菌基因組DNA.采用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)經(jīng)PCR從細菌基因組DNA中擴增出16S rRNA序列,PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行測序.通過BLAST軟件對測定16S rRNA基因序列進行同源性比較,選取同源性較高的序列,利用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與討論

2.1絞股藍根際ACC脫氨酶活性細菌的篩選

通過富集定向篩選，從絞股藍根際土壤中分離得到9株能在以ACC為唯一氮源的ADF培養(yǎng)基上生長的細菌.酶活力檢測結(jié)果顯示，菌株JDG122，JDG124，JDG126，JDG127，JDG186，JDG188，JDG191，JDG192和JDG223的酶活力分別為0.042，0.032，0.292，0.521，0.271，0.322，0.171，0.057，0.463 U/mg，其中JDG127菌株的酶活力最高.

2.2根際細菌的產(chǎn)鐵載體能力

在CAS平板上檢測9株ACC脫氨酶活性菌株的產(chǎn)嗜鐵素能力.結(jié)果顯示，菌株JDG127，JDG122，JDG124和JDG191均能產(chǎn)生嗜鐵素，其中菌株JDG127的產(chǎn)嗜鐵素能力最強，而菌株JDG126，JDG186，JDG188，JDG192和JDG223均為嗜鐵素陰性(見圖1).

圖1 具ACC脫氨酶活性菌株的產(chǎn)嗜鐵素能力的CAS平板檢測結(jié)果

2.3具ACC脫氨酶活性細菌的促生作用

與大腸桿菌DH5α處理組和無菌水處理組相比，9株ACC脫氨酶活性菌株對水稻種子的萌發(fā)率均沒有明顯的影響.促生試驗結(jié)果顯示，9株ACC脫氨酶活性菌株中，7株菌株對水稻幼苗根系的生長發(fā)育表現(xiàn)不同程度的促生作用(見表1)，其中菌株JDG127接種處理組水稻幼苗的根長為9.8 cm和根鮮重為0.84 g，與對照組相比，其根長和鮮重分別增長了55%和52%(見圖2)，表明JDG127菌株具有較強的促生作用.

表1 具ACC脫氨酶根際細菌對水稻幼苗根長和根鮮重的促生效果

注 肩標a表示接種處理組的幼苗根長及其鮮重顯著高于未接種對照組(P<0.01);肩標b表示接種處理組的幼苗根長及其鮮重均顯著高于未接種對照組(P<0.05).

圖2 菌株JDG127對水稻幼苗根系的促生作用

2.4具ACC脫氨酶活性細菌的形態(tài)及生理生化特征

將9株具ACC脫氨酶活性菌株的形態(tài)特征和生理生化特征(見表2)與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應(yīng)屬、種進行對照.初步鑒定結(jié)果表明，JDG223屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，JDG122，JDG124，JDG127和JDG186屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)，JDG126屬于單胞菌屬(Stenotrophomonas)，JDG188和JDG192屬于腸桿菌屬(Enterobacter)，而JDG191屬于類芽胞桿菌屬(Paenibacillus).

表2 具ACC脫氨酶活性絞股藍根際細菌的形態(tài)及生理生化特征

2.5具ACC脫氨酶活性細菌16SrRNA序列分析

用通用引物從9株絞股藍根際ACC脫氨酶活性菌株基因組中擴增出1.4 kb左右的PCR片段，并進行DNA測序.通過BLAST軟件對測定16S rRNA基因序列進行同源性分析，從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取同源性較高的序列，利用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3—5所示.從圖3可知，JDG122，JDG127，JDG124，JDG186與Acinetobacter屬的9個種類歸在一個簇群中，JDG122和JDG127與AcinetobacterbereziniaeATCC 17924的同源性分別為98%和99%，JDG124與AcinetobacterguillouiaeATCC 11171的同源性為99%，而JDG186與AcinetobacterbaumanniiATCC 19606的同源性為98%；從圖4可知，JDG188和JDG192與Enterobacter屬的3個種類歸在一個簇群中，JDG188和JDG192與Enterobactersp.E4M-P和EnterobacterasburiaeM16的同源性均為99%，而JDG126與Stenotrophomonas屬的2個種類聚在一起，與Stenotrophomonassp.MH107的同源性為99%；從圖5可知，JDG191與PaenibacillusxylanexedensB22a聚在一起，而JDG223與BacillusweihenstephanensisWSBC 10204 聚在一起，它們的同源性均為98%.進一步結(jié)合生理生化試驗結(jié)果，將菌株JDG-122，JDG-127，JDG-124，JDG-186分別鑒定為Acinetobacterbereziniae，Acinetobacterbereziniae，Acinetobacterguillouiae，Acinetobacterbaumannii，菌株JDG192和JDG188分別鑒定為Enterobacterasburiae和Enterobactersp.，而菌株JDG126，JDG191和JDG223分別鑒定為Stenotrophomonassp.，Paenibacillusxylanexedens和Bacillusweihenstephanensis.本研究結(jié)果表明，絞股藍根際具ACC脫氨酶活性細菌具有較豐富的種屬多樣性.

圖3 菌株JDG122，JDG124，JDG127和JDG186的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 菌株JDG188，JDG192和JDG126的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 菌株JDG191和JDG223的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 分析

(1)采用富集篩選法從絞股藍根際土壤中分離得到9株具有ACC脫氨酶活性的根際細菌，其中菌株JDG127的ACC脫氨酶活性最高(0.521 U/mg)，比文獻[6]報道的草莓根際產(chǎn)酸菌ACC30株ACC脫氨酶活性(0.217 U/mg)高出2倍，而與文獻[11]報道的杜仲內(nèi)生假單胞菌JDM-2株ACC脫氨酶活性(0.468 U/mg)基本相等，表明菌株JDG127具有較高的ACC脫氨酶活性.

(2)文獻[1]報道，絕大多數(shù)根際促生細菌通過非核糖體途徑合成分泌1種或幾種鐵載體，而鐵載體通過提高植物根際土壤中鐵的可用性以直接的方式促進植物的生長.文獻[12]報道了從水稻根際土壤中分離得到能產(chǎn)生植物生長激素IAA的固氮菌、肺炎克雷伯菌、沙雷氏菌和假單胞菌等根際細菌，通過CAS平板法檢測它們的鐵載體合成能力，結(jié)果顯示只有假單胞菌屬菌株能合成鐵載體，抑菌試驗結(jié)果顯示惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌對馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)有較強的拮抗作用.文獻[13]報道了用熒光素標記的鐵載體ferrioxamine B探討植物根系對細菌鐵載體的吸收情況，結(jié)果顯示根際促生細菌只有定殖植物組織內(nèi)部或根表時玉米和棉花才能吸收利用鐵載體.文獻[14]報道了構(gòu)建一株苜蓿根瘤菌的嗜鐵素突變株，并檢測其結(jié)瘤作用，結(jié)果顯示與野生株相比突變株的固氮作用明顯降低，表明根瘤菌的固氮作用也依賴于根瘤菌鐵載體的合成，因為固氮酶活性的維持需要鐵.從上述研究結(jié)果可以看出，嗜鐵素的存在對于根際細菌和植物無疑具有特殊的意義.筆者利用CAS平板法檢測9株絞股藍根際ACC脫氨酶活性細菌的產(chǎn)生鐵載體的能力，結(jié)果顯示只有4株菌可產(chǎn)鐵載體的細菌，但它們的ACC脫氨酶活性顯著低于不產(chǎn)鐵載體菌株的ACC脫氨酶活性，提示根際細菌的ACC脫氨酶活性和產(chǎn)鐵載體能力間可能無相關(guān)性.

(3)采用菌液培養(yǎng)接種法對篩選獲得的9株ACC脫氨酶活性菌株進行促生效應(yīng)的檢測，結(jié)果顯示7株菌對水稻幼苗根系的生長發(fā)育表現(xiàn)出不同程度的促生作用，其中菌株JDG127的促生作用最為顯著，但另2株具有較高ACC脫氨酶活性的菌株JDG126和JDG188沒有促生作用，表明具有ACC脫氨酶活性的不同菌種對植物的促生作用及其機制可能有一定的差異.而4株可產(chǎn)鐵載體的ACC脫氨酶活性菌株對水稻幼苗根系的促生作用顯著高于不產(chǎn)鐵載體的ACC脫氨酶活性菌株，表明產(chǎn)生鐵載體是植物根際促進宿主生長發(fā)育的一個重要途徑，并提示根際細菌ACC脫氨酶活性和鐵載體活性之間可能沒有相關(guān)性，但根際促生細菌ACC脫氨酶和鐵載體的關(guān)系及其作用機制還需要進一步研究.

(4)文獻[15]中的研究結(jié)果表明，絞股藍根際細菌、放線菌和氮素生理類群數(shù)量隨模擬酸雨pH值的降低而明顯減少，但未鑒定絞股藍根際細菌的種屬特異性.筆者首次從湖南省吉首市德夯國家級重點風景名勝區(qū)絞股藍根際中分離得到9株ACC脫氨酶陽性細菌，鑒定結(jié)果顯示9株細菌中有1株屬于單胞菌屬，1株屬于類芽胞桿菌屬，1株屬于芽孢桿菌屬，2株屬于腸桿菌屬，4株屬于不動桿菌屬，表明絞股藍根際ACC脫氨酶陽性細菌具有豐富的種屬多樣性.CAS平板檢測結(jié)果顯示，9株ACC脫氨酶陽性菌株中只有4株菌能合成鐵載體，其中2株為不動桿菌屬菌種，1株為芽孢桿菌屬菌種，而它們對水稻幼苗根系的促生作用最強，表明鐵載體是根際促生細菌的主要促生因子之一.

綜上所述，4株具有ACC脫氨酶活性和可產(chǎn)鐵載體的菌株對水稻幼苗根系的促生作用明顯，下一步將開展這4株菌作為微生物肥料的研發(fā)，并進行大田促生試驗研究.

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(責任編輯 陳炳權(quán))

IsolationandPlantGrowth-PromotingAbilityofACCDeaminase-ContainingBacteriafromRhizosphereofGynostemmaPentaphyllumMakino

SONG Jinqiu,NAZIERBIEKE Wulumuhan,ZHANG ti,BORRATHYBAY Entomack

(College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

A total of 9 bacterial strains were isolated from rhizosphere ofGynostemmapentaphyllumthrough enrichment on 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) as a sole nitrogen source.ACC deaminase assay showed that all isolates differed in their potential for ACC deaminse activity,among which 3 strains were positive for siderosphere by chrome azurol S (CAS) assay.Inoculation of rice seedlings with 7 ACC deaminase-containing strains had significant effect on root elongation and root fresh weight,among which the strain JDG127 caused 1.6-fold increase in root length and root fresh weight over uninoculated control.Based on the physiological and biochemical characteristics in combination with 16S rRNA gene sequences analysis,the 9 ACC deaminase- containing strains were identified asStenotrophomonas(1 strain),Paenibacillus(1 strain),Bacillus(1 strain),Enterobacter(2 strains) andAcinetobacter(4 strains).The results indicated that the siderosphere producing ability of rhizobacteria may be correlated with their plant growth-promoting ability when compared to their ACC-deaminase activity.

Gynostemmapentaphyllum;rhizobacteria;ACC deaminase;growth-promoting ability

1007-2985(2014)05-0043-08

2014-06-15

生態(tài)旅游湖南省重點實驗室開放基金資助項目(JDSTLY201202)；國家自然科學基金資助項目(31260039)

宋金秋(1982—)，女，湖南吉首人，吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院碩士生，主要從事微生物生態(tài)學研究

恩特馬克·布拉提白(1961—)，男，新疆人，吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院教授，博士，主要從事動物病原微生物學研究；E-mail etmkb@jsu.edu.cn.

R285.5

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.05.011