響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花中黃酮類物質(zhì)提取條件

關(guān)炳峰，王 永，郭良起，李向力

(河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450002)

金銀花含有多種對(duì)人體有利的植物活性成分，如綠原酸、異綠原酸、木犀草素等黃酮類化合物，具有抗衰防癌、輕身健體的良好功效。黃酮類物質(zhì)的提取方法有水提法、乙醇提取法、超聲波提取法、酶解醇提法等［1－4］。周春暉等［5］研究了水提法的工藝條件，李榮等［6］以總黃酮得率為指標(biāo)，用乙醇法進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化，李曉軍［7］等研究了超聲波法提取對(duì)金銀花中黃酮類物質(zhì)的影響。總的來(lái)說(shuō)，水提法節(jié)省資源，但是得率低，并且雜質(zhì)比較多，后續(xù)處理困難。超聲波提取法局部產(chǎn)生較高的溫度導(dǎo)致活性物質(zhì)喪失活性，且生產(chǎn)成本高，很難適應(yīng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的需求，因此不適宜采用。酶法在提取的同時(shí)可能與金銀花中的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，而降低了活性物質(zhì)的提取量，而且酶的價(jià)格也比較昂貴，限制了酶解提取法在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。而乙醇提取法有成本低、得率高、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。

本文以乙醇為溶劑，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了金銀花中黃酮類物質(zhì)提取條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花(水分含量1.00%，灰分含量6.31%)由浙江省溫州市瑞安九譚金銀花加工基地提供，金銀花干花粉碎，過(guò)40目篩，密封保存;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品武漢市華順生物技術(shù)有限公司;乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁 均為分析純。

SD－250渦輪式粉碎機(jī) 浙江省嵊縣特種粉碎設(shè)備廠;UV－265 FW型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;RE52－99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以干燥粉末(水分含量為1.00%)為原料，稱取2.000g樣品，放到50mL燒杯中，加入乙醇，在電熱恒溫水浴鍋中恒溫加熱一定時(shí)間，收集上部液體，重復(fù)加熱提取。將液體真空抽濾，將濾液置于離心機(jī)中以4200r/min離心30min取出，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至乙醇含量很少(以不能聞出酒精味為宜)，將濃縮液倒入50mL的容量瓶中，用蒸餾水定容。

按表1條件進(jìn)行提取［8］，提取后用分光光度法來(lái)測(cè)定并計(jì)算提取率，分析乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取液pH這6個(gè)因素對(duì)提取率的影響。

表1 提取條件的因素和水平表Table 1 Factors and levels of extraction

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［9－14］以單因素實(shí)驗(yàn)確定響應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素與水平，在料液比1∶15、提取次數(shù)3次、pH自然條件下，選取乙醇濃度X1、提取溫度X2、提取時(shí)間X3三個(gè)因素，設(shè)計(jì)三因素二次回歸旋轉(zhuǎn)正交組合方案表2。

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素編碼表Table 2 Factors and levels ofdual quadratic rotary combination design

1.2.3 金銀花中黃酮類物質(zhì)的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0224g于100mL容量瓶中，95%乙醇溶解，搖勻，定容。取 0、2、4、6、8mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25mL比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%氫氧化鈉10mL，加水至刻度，搖勻，靜置15min，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［15］。將實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的吸光度直接代入該公式，可以直接得到提取液中黃酮類物質(zhì)的含量。

金銀花中黃酮提取得率(mg/g)=金銀花總黃酮提取液凍干后的質(zhì)量/金銀花粉末質(zhì)量

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用SAS軟件，對(duì)設(shè)計(jì)的三因素二次回歸旋轉(zhuǎn)正交進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并進(jìn)行二次多元回歸擬合，并考察3個(gè)因素之間的交互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花中黃酮類物質(zhì)提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選擇溫度60℃、料液比為1∶15、提取時(shí)間為2h、提取次數(shù)為3次，提取pH為7，研究乙醇濃度對(duì)提取率的影響。由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增大，黃酮類物質(zhì)的含量不斷升高。在乙醇的濃度達(dá)到60%前，黃酮類物質(zhì)的得率隨乙醇濃度的升高提高較快;當(dāng)乙醇濃度大于60%后，黃酮類物質(zhì)得率的增加速率明顯變慢。因此，選擇乙醇濃度為60%。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction

選擇乙醇濃度為60%，其他條件不變，研究溫度對(duì)提取率的影響。由圖2可以看出，在60℃前黃酮類物質(zhì)的得率隨溫度升高而升高，到達(dá)60℃時(shí)，黃酮類活性物質(zhì)具有最高得率，而當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，黃酮類物質(zhì)的得率降低。當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，金銀花中黃酮類物質(zhì)因溫度高而發(fā)生變化，從而影響了黃酮類物質(zhì)的提取。因此，選擇提取溫度為60℃。

圖2 提取溫度對(duì)提取的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction

選擇乙醇濃度為60%、溫度60℃，其他條件不變，研究料液比對(duì)提取率的影響。由圖3可以看出，開(kāi)始時(shí)黃酮類物質(zhì)得率的增長(zhǎng)較快，而在料液比為1∶20時(shí)，增長(zhǎng)速度明顯變慢。可見(jiàn)在一定范圍內(nèi)提取溶劑的增多，可以使黃酮類物質(zhì)提取率增加，但是當(dāng)提取溶劑增加到一定程度時(shí)，黃酮類物質(zhì)的提取已經(jīng)達(dá)到飽和，提取率增長(zhǎng)速度就會(huì)變慢。因此，選擇料液比是 1∶20。

圖3 料液比對(duì)提取的影響Fig.3 Effect of ratio of solid to liquids on extraction

選擇乙醇濃度為60%、溫度60℃、料液比為1∶20、提取時(shí)間為2h、提取pH不變，研究提取次數(shù)對(duì)提取率的影響。由圖4可以看出，隨著提取次數(shù)的增多，所獲得的黃酮類物質(zhì)是不斷增多的，但是當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次以上時(shí)，黃酮類物質(zhì)的得率增長(zhǎng)速度變慢?？梢?jiàn)，多次提取可以提高對(duì)金銀花中黃酮類物質(zhì)的提取，但是當(dāng)提取次數(shù)到一定程度時(shí)，金銀花中黃酮類物質(zhì)的提取已經(jīng)接近飽和，所以提取率的增長(zhǎng)就會(huì)變小。因此，選擇的提取次數(shù)為3次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)提取的影響Fig.4 Effect of extracting times on extraction

選擇乙醇濃度為60%、溫度60℃、料液比為1∶20，其他條件不變，研究提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。由圖5中可以看出，從1h開(kāi)始，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)的提取量增加，當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)2h后，黃酮得率開(kāi)始明顯降低?？梢?jiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)黃酮類物質(zhì)的提取不利。因此，選擇的提取時(shí)間為2h。

圖5 提取時(shí)間對(duì)提取的影響Fig.5 Effect of extracting time on extraction

選擇乙醇濃度為60%、溫度60℃、料液比為1∶20、提取時(shí)間為2h、提取次數(shù)為3次，研究提取pH對(duì)提取率的影響。圖6中可以看出，黃酮類物質(zhì)的得率具有不規(guī)律性，當(dāng)提取溶液pH為6時(shí)，黃酮類物質(zhì)的得率最高，其它pH時(shí)，黃酮類物質(zhì)的得率變動(dòng)較大。當(dāng)提取溶液的pH從7向酸堿兩個(gè)方向移動(dòng)時(shí)，黃酮類物質(zhì)總的得率不斷減少。可見(jiàn)，當(dāng)提取溶液的pH呈現(xiàn)較強(qiáng)的酸性或堿性時(shí)，金銀花中的黃酮類物質(zhì)會(huì)因?yàn)閜H的變化而發(fā)生一定的化學(xué)反應(yīng)或本身性質(zhì)發(fā)生變化，而不易被提取出來(lái)。因此，選擇的提取pH為7。

2.2 旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照三因素二次旋轉(zhuǎn)正交回歸設(shè)計(jì)方案，制備出23組浸提樣，分別測(cè)定黃酮類物質(zhì)的含量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線y=11.088x－0.0002(R2=0.9999)計(jì)算結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3:

圖6 溶液pH對(duì)提取的影響Fig.6 Effect of pH value on extraction

利用SAS軟件，對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，剔除不顯著因素和不顯著的交互作用，得到黃酮類物質(zhì)的含量隨乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)回歸模型為:Y=128.68X0－4.39X1－5.00－4.23

2.3 回歸模型的檢驗(yàn)

利用SAS軟件，對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由表4可以得知，在顯著水平α=0.01時(shí)，回歸方程式F檢驗(yàn)顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況擬和較好。F檢驗(yàn)反映的是回歸模型的有效性，由表4可知，回歸模型達(dá)到極顯著水平，表明回歸模型能夠較好地描述各因素與響應(yīng)值的關(guān)系。

表4 回歸方差各項(xiàng)的方差分析Table 4 Coding coefficients for the independent variable

由表 5 T－檢驗(yàn)結(jié)果表明，X2、X3、X1X2、X1X3和X2X3的回歸系數(shù)不顯著，因而原方程可以簡(jiǎn)化為:Y=128.68X0－4.39X1－5.00－4.23。根據(jù)各變量的顯著性檢驗(yàn)可以得出三個(gè)單因素的主次關(guān)系:乙醇濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間。通過(guò)SAS分析得到最佳工藝:乙醇濃度為65%、提取溫度為65℃、提取時(shí)間1.75h。

表5 T－檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of T－test

2.3.1 雙因素交互作用對(duì)提取量的影響 由圖7可見(jiàn)，乙醇濃度X1和提取溫度X2有交互作用，在單因素對(duì)黃酮類物質(zhì)提取的結(jié)果中，黃酮類物質(zhì)的提取量隨乙醇濃度的提高而增大;而由于乙醇濃度X1和提取溫度X2有交互作用，使提取量出現(xiàn)一個(gè)峰值。因而提取金銀花中黃酮類物質(zhì)，乙醇濃度X1和提取溫度X2不能升高過(guò)度。由圖8可見(jiàn)，乙醇濃度X1和提取時(shí)間X3有交互作用。低濃度較長(zhǎng)時(shí)間和低濃度較短時(shí)間的提取量相差不多，同一濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)提取量會(huì)先高后低。而提取時(shí)間過(guò)高長(zhǎng)會(huì)影響提取量和提取物的性質(zhì)。由圖9可見(jiàn)，提取溫度X2和提取時(shí)間X3有交互作用，當(dāng)提取溫度X2和提取時(shí)間X3都增大時(shí)，提取量也增大，當(dāng)達(dá)到一定值時(shí)，提取量就有所下降。

表3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果表Table 3 Testing scheme and results of dual quadratic rotary combination design

圖7 乙醇濃度(X1)和提取溫度(X2)對(duì)提取量(Y)的影響Fig.7 Effect of alcohol concentration and extracting temperature on extraction

2.3.2 模型的驗(yàn)證 在乙醇濃度為65%、提取溫度為65℃、提取時(shí)間1.75h、料液比是1∶20、提取次數(shù)為3次、提取pH為7條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行3次實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為 128.21、129.04、128.55mg/g，平均值為128.60mg/g，相對(duì)誤差為0.85%，與預(yù)測(cè)值較為接近，證明響應(yīng)面分析法得到的金銀花中黃酮類物質(zhì)提取條件是可行的。

圖8 乙醇濃度(X1)和提取時(shí)間(X3)對(duì)提取量(Y)的影響Fig.8 Effect of alcohol concentration and extracting time on extraction

圖9 提取溫度(X2)和提取時(shí)間(X3)對(duì)提取量(Y)的影響Fig.9 Effect of extracting temperature and extracting time on extraction

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，金銀花中黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度為65%、提取溫度為65℃、提取時(shí)間1.75h、提取3次、料液比為1∶15、pH為7。在此優(yōu)化的工藝條件下金銀花中黃酮類物質(zhì)的提取量達(dá)到128.60mg/g。

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