蟲茶香氣成分分析和體外功能性效果

王?！≮w欣

摘要：通過氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析、清除DPPH自由基試驗、抗突變試驗、AGS及HT-29癌細胞增殖抑制試驗，明確蟲茶的香氣成分及其體外功效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蟲茶香氣成分主要包括11種，這些成分具有體外抗氧化、抗突變、抗癌效果。

關(guān)鍵詞：蟲茶；香氣成分；功效；抑制率

中圖分類號： TS275.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0327-03

收稿日期：2013-10-14

作者簡介：王睿（1982—），男，重慶人，碩士，講師，研究方向為功能性食品的保健效果。Tel：（023）65628256；E-mail：foods@live.cn。

通信作者：趙欣，博士，教授，研究方向為功能性食品的保健效果。Tel：（023）64099815；E-mail：zhaoxin@zhaoxin.org。蟲茶是一種特殊的保健茶，它不屬于普通茶的范疇，是以昆蟲食用葉片后經(jīng)過其體內(nèi)作用生產(chǎn)出來的特殊茶飲料[1]。目前，用來生產(chǎn)蟲茶的昆蟲有夜蛾科弓須亥夜蛾、雪疽夜蛾、螟蛾科米縞螟、白條谷螟，這些昆蟲的幼蟲取食苦藤茶、蟲茶、化香樹、大百解、三葉海棠等植物葉片后，排出顆粒，將其收集后經(jīng)過一系列加工的產(chǎn)品即為蟲茶產(chǎn)品[1]。蟲茶作為傳統(tǒng)飲品和中藥，具有清熱、去暑、解毒、健胃、助消化等功效，對腹瀉、鼻衄、牙齦出血、痔出血均有較好療效，是一種很好的醫(yī)藥保健飲料[2]。傳統(tǒng)飲茶方式是用熱水沖泡茶葉，大量揮發(fā)性成分在沖泡過程中散失，泡茶過程中的香氣就是這些揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生的。近年來，關(guān)于茶葉香氣成分的研究已經(jīng)陸續(xù)開展[3]，蟲茶香氣成分及其作用有待于研究。本研究通過氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法對貴州省產(chǎn)蟲茶的香氣成分進行了分析，并對這些香氣成分物質(zhì)進行了體外的抗氧化、抗突變、抗癌試驗，以期為推廣蟲茶提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試蟲茶為市售、原產(chǎn)于貴州省的蟲茶。

試劑：無水乙醚（色譜純）、癸酸乙酯（色譜純）、無水硫酸鈉（分析純），上海士瑞化工實業(yè)有限公司生產(chǎn)；NaH2PO4·2H2O、FeCl3、三氯乙酸，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；2-硫代巴比妥酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、維生素C、D- biotin、L- histidineoHCl（monohydrate）、D- glucose- 6- phosphate、NADP，美國Sigma公司生產(chǎn)；DMSO，日本純正化學(xué)株式會社生產(chǎn)；RPMI 1640 培養(yǎng)液、FBS、trypsin、EDTA、100 U/mL Penicillin- Streptomycin，美國Gibco公司生產(chǎn)。

致突變物：N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG），美國Aldrich公司生產(chǎn)。標準菌株：TA100營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙氏菌，美國Sigma公司生產(chǎn)。癌細胞：AGS 胃癌細胞株、HT-29 結(jié)腸癌細胞株，韓國細胞株銀行生產(chǎn)。

1.2主要儀器和設(shè)備

LS-B75L型高壓蒸氣滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；WPL-30型恒溫培養(yǎng)箱，江東精密儀器有限公司；同時蒸餾萃?。⊿DE）裝置，安徽省天長市華玻實驗儀器廠；UV-1750型紫外分光光度計，日本島津公司；Agilent 7890/5975 GC-MS（配置電子轟擊源），美國安捷倫公司；VS-15CFN型冷凍離心機，韓國Vision科學(xué)株式會社；MC096型二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋電機株式會社；Elx800型酶標儀，美國Bio Tekinstruments公司。

1.3試驗方法

1.3.1蟲茶香氣物質(zhì)的提取通過SDE法對蟲茶香氣物質(zhì)進行提取。將蟲茶樣品打碎，稱取50 g于SDE裝置的2 L圓底燒瓶中，加入煮沸的蒸餾水1 L，同時加入10 g/mL癸酸乙酯0.5 mL以及少許玻璃珠，用50 mL重蒸乙醚萃取。對電熱套加熱，微沸下提取20 min。向乙醚萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分。4 ℃靜置1 d后用N2濃縮提取液至0.2 mL，重復(fù)該過程5次，將5次收集到的提取液合并，冷凍干燥后加入DMSO備用[4]。

1.3.2GC-MS法測定蟲茶成分和含量GC分析條件：HP-5 MS柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度 250 ℃；載氣為高純He，恒流模式，流速為1 mL/min；初始溫度 50 ℃，保留1 min，10 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，5 ℃/min 升至280 ℃，保持4 min，50 ℃/min升至300 ℃，保持2 min。進樣量1 mL，進樣方式為不分流。EI-MS分析條件：離子源溫度280 ℃；電離能量70 eV；溶劑延遲時間4 min；電子轟擊電離源（EI）。將得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對照標準譜庫對蟲茶香氣成分進行確認。并用各香氣組分的峰面積占總峰面積的比值表示各組分的相對含量。

1.3.3羥基自由基清除能力測定將6 mol/L脫氧核糖溶液0.2 mL、pH值7.4的磷酸鈉緩沖溶液0.2 mL、400 mmol/L FeCl3溶液0.2 mL、400 mmol/L FeSO4-EDTA溶液0.2 mL、3 mol/L H2O2溶液0.2 mL、400 mmol/L 維生素C溶液 0.2 mL、0.2 mL蟲茶香氣物質(zhì)溶液混合，在37 ℃水浴中放置 1 h，再加入1 mL三氯乙酸、1 mL 2-硫代巴比妥酸，將混合溶液在90 ℃水浴中煮沸20～25 min后在532 nm波長處測定吸光度，計算清除自由基能力[5]。

1.3.4DPPH自由基清除能力測定將不同濃度蟲茶香氣物質(zhì)100 μL和0.15 mmol/L DPPH試劑60 μL混勻后，加入96孔板中室溫下避光放置30 min，再在540 nm波長下測定吸光度。按下式計算清除DPPH自由基能力[6]：endprint

清除DPPH自由基能力=（對照值-對照空白值）-（樣品值-樣品空白值）對照值-對照空白值×100%。

式中：對照為沒有加入樣品孔，空白為加入樣品但沒有加入DPPH試劑孔。

1.3.5Ames抗突變試驗蟲茶香氣物質(zhì)提取物設(shè)2個試驗劑量組（1.25、2.5 mg/皿）、自發(fā)回變組、對照組，每組設(shè)3 個平行皿。向滅菌試管中加入磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)12 h后的 10億～20億個/mL的菌株0.1 mL、樣品物質(zhì)提取物溶液 50 μL、致突變物（MNNG）50 μL，輕微振蕩后于37 ℃下放置30 min，加入頂層培養(yǎng)基2 mL混合，再倒在底層培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)2 d，進行平板計數(shù)。按下式計算抑制率[7]：

抑制率=[（對照組菌落數(shù)-樣品處理組菌落數(shù)）/（對照組菌落數(shù)-自發(fā)回變組菌落數(shù)）]×100%。

1.3.6MMT法測定蟲茶香氣物質(zhì)提取物的體外癌細胞增殖抑制效果將AGS胃癌細胞和HT-29結(jié)腸癌細胞復(fù)蘇后接種在含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，將癌細胞置于培養(yǎng)箱中以5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每周更換培養(yǎng)液2～3次并進行傳代培養(yǎng)1次。按200 μL/孔將含癌細胞的培養(yǎng)液接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液的癌細胞濃度為 1萬個/mL，然后將96孔培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 d，吸出96孔板中的培養(yǎng)液，加入蟲茶香氣物質(zhì)提取物的培養(yǎng)液 200 μL。再經(jīng)過2 d培養(yǎng)后，再次吸出各孔內(nèi)上清液，再向各孔加入5 g/L MTT試劑200 μL后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出各孔內(nèi)的上清液，在每孔中加入200 μL DMSO后避光振蕩 30 min，用酶標儀在540 nm波長下測定各孔吸光度，按下式計算細胞增殖抑制率[8]：

抑制率=[（空白孔吸光度值-樣品孔吸光度值）/空白孔吸光度值]×100%。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，各數(shù)據(jù)間差異顯著性比較采用 SAS軟件進行統(tǒng)計學(xué)檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1蟲茶香氣成分的分析

通過GC-MS法分析（圖1）可知，蟲茶香氣物質(zhì)中主要含有5-乙基-2-oxa-1，3，4，5a，10-pentaazacyclopenta-[a]芴（5837 min）、癸烷（6.043 min）、（9-oxo-9，10-dihydroacridin-4-yl）乙酸（6.532 min）、7-氯-4-甲氧基-3-甲基喹啉（7.342 min）、1-（3-氫氧化-4 -甲苯基）-1，3，3，6-四甲基-5-茚滿醇（9.826 min）、丙烯酮（11.454 min）、4-氨基苯乙烯酸（12.891 min）、草酰胺（12906 min）、縮水甘油（13.960 min）、2-乙?；?1，3，3，4，4-五甲基環(huán)戊烯縮氨基脲（16.987 min）、棕櫚酸（18.400 min）這11種化合物在蟲茶中的含量分別為1353%、9.242%、7733%、2.280%、1.189%、2.508%、2981%、0.448%、0533%、1901%、1.566%。

2.2蟲茶香氣成分的抗氧化效果

通過測定蟲茶揮發(fā)性物質(zhì)提取物的羥基自由基、DPPH自由基清除能力可以判斷蟲茶香氣物質(zhì)的抗氧化效果。由圖2、圖3可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著蟲茶揮發(fā)性物質(zhì)提取物濃度的升高，蟲茶揮發(fā)性物質(zhì)提取物的羥基自由基、DPPH自由基清除能力均得到提高。已有研究表明，香氣成分中的棕櫚酸等物質(zhì)具有抗氧化效果[9]，這些物質(zhì)的存在使得蟲茶香氣成分具有抗氧化效果。

2.3蟲茶香氣成分的抗突變效果

MNNG是一種廣泛存在的化學(xué)誘變劑和致癌劑，其引起的突變與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，通過體外抗突變試驗可以從一定程度上判斷食品的抗突變性[10]。

3結(jié)論

蟲茶香氣物質(zhì)中主要含有11種成分，分別為5-乙基-2-oxa-1，3，4，5a，10-pentaazacyclopenta-[a]芴、癸烷、（9-oxo-9，10-dihydroacridin-4-yl）乙酸、7-氯-4-甲氧基-3-甲基喹啉、1-（3-氫氧化-4 -甲苯基）-1，3，3，6-四甲基-5-茚滿醇、丙烯酮、4-氨基苯乙烯酸、草酰胺、縮水甘油、2-乙?；?1，3，3，4，4-五甲基環(huán)戊烯縮氨基脲、棕櫚酸。通過對蟲茶香氣物質(zhì)清除羥基自由基和DPPH自由基的能力測定發(fā)現(xiàn)，蟲茶香氣物質(zhì)具有一定的抗氧化能力，并且隨蟲茶揮發(fā)性物質(zhì)提取物濃度的增大，抗氧化效果也增加。通過Ames抗突變試驗檢驗蟲茶香氣物質(zhì)對TA100沙門氏菌的增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蟲茶香氣物質(zhì)顯示出良好的抗突變效果。蟲茶香氣物質(zhì)對AGS胃癌細胞、HT-29結(jié)腸癌細胞處理后，癌細胞的體外增殖都明顯減少。成分分析試驗和體外功能性效果試驗證明，蟲茶香氣成分具有體外抗氧化、抗突變、抗癌效果，改進飲茶方式或加強工業(yè)茶飲料的制作工藝，保留蟲茶香氣成分，可以進一步利用蟲茶的使用價值和保健價值。

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