辣椒疫霉NPP效應(yīng)子基因家族生物信息學(xué)分析

馮寶珍+李培謙+成娟麗等

摘要：NPP（necrosis-inducing Phytophthora protein）是一類(lèi)效應(yīng)子，在卵菌疫霉屬病原菌中普遍存在，該類(lèi)蛋白能夠激發(fā)植物的防御反應(yīng)，如引起植物細(xì)胞死亡、促使寄主防御基因表達(dá)及產(chǎn)生乙烯。利用生物信息學(xué)方法對(duì)辣椒疫霉（Phytophthora capsici）基因組內(nèi)的NPP基因家族存在狀況進(jìn)行分析，并對(duì)其氨基酸序列組成、基本理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，旨在了解其結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)而發(fā)掘辣椒疫霉的致病相關(guān)基因。結(jié)果表明：NPP基因家族有25個(gè)成員，其中大部分成員存在多個(gè)拷貝。對(duì)25個(gè)NPP氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其分子量在12.45～88.9 ku之間；對(duì)其中15個(gè)NPP蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，它們的三維結(jié)構(gòu)類(lèi)似，其主要的結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋和β-片層；構(gòu)建了25個(gè)NPP蛋白的進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行了分子進(jìn)化分析。

關(guān)鍵詞：辣椒疫霉；NPP基因家族；效應(yīng)子；生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.418.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0028-04

收稿日期：2013-10-02

基金項(xiàng)目：山西省高?？萍柬?xiàng)目（編號(hào)：20121025）；山西省青年科技研究基金（編號(hào)：2013021024-6）

作者簡(jiǎn)介：馮寶珍（1981—），女，山東臨沂人，博士，講師，主要從事分子植物病理學(xué)研究。E-mail：fengbaozhen@126.com。效應(yīng)子（effector）是病原物產(chǎn)生的各種能夠壓制或平衡寄主防御系統(tǒng)的分子。在侵染過(guò)程中，病原物以效應(yīng)子為關(guān)鍵武器突破寄主的防御系統(tǒng)，一方面能減弱寄主抵抗力以成功侵入，另一方面還能利用寄主的養(yǎng)分以利于自身增殖[1-2]。許多病原物都能分泌效應(yīng)子，在細(xì)菌、真菌、卵菌及線(xiàn)蟲(chóng)中都發(fā)現(xiàn)了效應(yīng)子[3]。病原物中存在的效應(yīng)子有許多種，包括NPP[4]、無(wú)毒基因（Avr）[5]、CRN[6]、PcF[7]、ScR[8]、糖類(lèi)水解酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶以及酯酶[7]等，其中NPP（necrosis-inducing Phytophthora protein）也被稱(chēng)為NLP（NEP1-like protein），此類(lèi)基因在卵菌、真菌、細(xì)菌中普遍存在[8]，但在細(xì)菌、真菌基因組內(nèi)的數(shù)量較少，一般為1～4個(gè)，而在卵菌基因組中的數(shù)量較多，且多數(shù)以基因家族形式存在，如在大豆疫霉（Phytophthora sojea）中約有29個(gè)，在橡膠疫霉（Phytohthora ramorum）中約有40個(gè)[9]。多數(shù)植物被NPP蛋白處理后表現(xiàn)為產(chǎn)生乙烯、MAP激酶活化、植保素合成、PR基因誘導(dǎo)表達(dá)、胞質(zhì)Ca2+釋放以及多種雙子葉植物的葉片壞死反應(yīng)等現(xiàn)象。最早報(bào)道的NPP蛋白NEP1來(lái)自鐮刀菌（Fusarisum oxysporium），能夠引起雙子葉植物葉片壞死[10]。后來(lái)在腐霉（Pythium aphanidermatum）中分離了該類(lèi)基因PaNie，發(fā)現(xiàn)其原核表達(dá)產(chǎn)物能使胡蘿卜、擬南芥及煙草等細(xì)胞死亡[11]。Fellbrich等研究了Phytohthora parasitica的NPP1基因，發(fā)現(xiàn)其原核表達(dá)產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)歐芹及擬南芥體內(nèi)產(chǎn)生pathogenesis-related（PR）蛋白、活性氧（ROS）和乙烯，并引起過(guò)敏性壞死反應(yīng)[12]。Keates等用NeP1處理斑點(diǎn)矢車(chē)菊、蒲公英、擬南芥，電鏡結(jié)果顯示，這些植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，可引起角質(zhì)層變薄、葉綠體降解等現(xiàn)象[13]。Bailey等分別用NeP1和Phytohthora megakarya游動(dòng)孢子處理不同生長(zhǎng)時(shí)期的可可葉片，發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)時(shí)期可可葉片的各類(lèi)抗逆基因表達(dá)水平不同，2種處理葉片中的抗逆基因表達(dá)模式相似，因此推測(cè)NeP1可能是一種感病因子[14]。棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）VdNEP基因的表達(dá)產(chǎn)物能使棉花、煙草、擬南芥葉片萎蔫，因此認(rèn)為VdNEP是棉花與病原物互作過(guò)程中的重要誘導(dǎo)因子[15]。敲除細(xì)菌Erwinia carotovora ssp. carotovora和E. carotovora ssp. atroseptica的NPP基因后再分別接種馬鈴薯塊莖，發(fā)現(xiàn)其毒性明顯下降[16]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆疫霉（P. sojae）的PsojNIP基因表達(dá)是在活體營(yíng)養(yǎng)向死體營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)換的過(guò)渡時(shí)期，并且只能引起雙子葉植物細(xì)胞死亡，因此認(rèn)為該基因在大豆疫霉半活體營(yíng)養(yǎng)生活過(guò)程中起到輔助病原在寄主植物中定殖的作用[17]。目前有人研究了這類(lèi)蛋白對(duì)植物的過(guò)敏反應(yīng)，但是這類(lèi)蛋白的功能及在植物中的作用模式還是未知的，更沒(méi)有足夠的證據(jù)證實(shí)NPP蛋白對(duì)疫霉毒性起重要作用。

辣椒疫霉（Phytohthora capsici）屬于卵菌綱，是一類(lèi)區(qū)別于真菌的真核生物，除了能夠引起辣椒疫病，還能夠引起多種茄科及葫蘆科植物疫病。辣椒疫病是一種土傳植物病害，廣泛分布于世界各地，且發(fā)病快、流行廣，易造成作物嚴(yán)重?fù)p失。大量使用傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑不僅使病原物產(chǎn)生了藥物抗性，而且造成的農(nóng)藥殘留更會(huì)嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生存環(huán)境。隨著基因工程及蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展，從基因和蛋白水平解釋植物病原的致病機(jī)理、挖掘致病相關(guān)基因、開(kāi)展抗病育種及研究抗病基因過(guò)程勢(shì)在必行。隨著辣椒疫霉全基因組測(cè)序的完成[9]，有關(guān)致病重要基因家族及靶基因預(yù)測(cè)分析等逐漸成為研究熱點(diǎn)。分析植物病原真菌關(guān)鍵致病基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)基團(tuán)的修飾特性，對(duì)于探索植物病原真菌致病性變異的機(jī)理具有重要的意義。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)展與辣椒疫霉致病性變異相關(guān)的基因簇大小、組成、亞組劃分及其關(guān)鍵基因的研究。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù)

辣椒疫霉基因組序列信息從DOE Joint Genome Institute（http：//genome.jgi.doe.gov/）下載。

雖然有些蛋白質(zhì)的基本元件個(gè)數(shù)相同，但它們的α-螺旋、β-片層以及無(wú)規(guī)則卷曲的長(zhǎng)度都存在一定差異，這些相似或者差異可能導(dǎo)致它們家族成員之間功能的多樣性。

3結(jié)論與討論

NPP效應(yīng)子的研究是當(dāng)前卵菌功能基因組學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。NPP效應(yīng)子基因家族在微生物中廣泛存在，目前已知的微生物有卵菌腐霉屬（P. aphanidermatum）[4]、疫霉屬（Phytophthora spp.）、真菌鐮刀菌（F. oxysporum）、鏈孢霉屬（Neurospora crassa）[21]，以及革蘭氏陽(yáng)性菌芽孢桿菌（Bacillus halodurans）、鏈霉菌屬（Streptomyces coelicolor），革蘭氏陰性菌歐文氏菌屬（Erwinia）[4]和弧菌屬（Vibrio pommerensis sp.）[22]，這些微生物中部分是植物病原菌，部分是動(dòng)物病原物，其侵染方式各異，表明NPP蛋白功能的多樣性。目前的研究集中于對(duì)部分植物病原NPP基因功能的分析，大部分NPP蛋白的功能都是未知的。據(jù)報(bào)道，NPP蛋白可參與寄主防御反應(yīng)，引起寄主的過(guò)敏性反應(yīng)。也有研究表明，有些病原物中的NPP蛋白與病原物致病性有關(guān)。本研究對(duì)辣椒疫霉NPP基因家族生物信息學(xué)進(jìn)行了分析，為深入開(kāi)展NPP基因在辣椒疫霉中的克隆、表達(dá)分析及生物學(xué)功能鑒定等方面的研究提供了重要基礎(chǔ)。

本研究以大豆疫霉NPP基因編碼蛋白為探針，對(duì)辣椒疫霉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索得到了25個(gè)NPP蛋白序列，利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件對(duì)這些序列進(jìn)行基因鑒定和蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)該家族不同成員之間的相互關(guān)系和演化歷程進(jìn)行了探討。對(duì)發(fā)掘辣椒疫霉致病基因、解析其關(guān)鍵基因?qū)τ谔剿髦参锊≡婢虏⌒宰儺惖臋C(jī)理及開(kāi)展抗病基因工程研究具有重要的意義。

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