HPLC-熒光法測定人血漿中厄貝沙坦?jié)舛?/h1>
2014-08-31 01:08:10周霞瑾齊惠珍張俊貞王明霞常青
河北醫(yī)藥 2014年11期
周霞瑾 齊惠珍 張俊貞 王明霞 常青
·藥物研究·
HPLC-熒光法測定人血漿中厄貝沙坦?jié)舛?/p>
周霞瑾 齊惠珍 張俊貞 王明霞 常青
目的建立人血漿中厄貝沙坦?jié)舛鹊腍PLC-熒光測定方法。方法以替米沙坦為內(nèi)標，乙醚-二氯甲烷(7∶3)提取的方法處理血漿。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為水-乙腈(57∶43)，磷酸調(diào)pH值=3.00，熒光激發(fā)波長為254 nm，發(fā)射波長為371 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為室溫。進樣量50 μl。結(jié)果厄貝沙坦和替米沙坦的保留時間分別為6.1 min和4.3 min，在0.05～5 μg/ml范圍內(nèi)厄貝沙坦檢測濃度線性關(guān)系良好(r=0.9996)，最低檢測濃度為0.023 μg/ml。高、中、低3種濃度(4、0.8、0.08 μg/mL)的平均相對回收率分別為(101.18±6.31)%、(102.22±5.32)%、(98.45±3.52)%，提取回收率為(78.05±6.66)%，日間、日內(nèi)RSD均小于10%。樣品3次凍融及在-20℃冰箱長期放置穩(wěn)定性良好。結(jié)論本實驗建立的方法準確、靈敏度和特異性高，可用于厄貝沙坦的藥代動學(xué)和藥物相互作用研究
厄貝沙坦；替米沙坦；HPLC；熒光檢測法；血藥濃度
厄貝沙坦為一類新型的非肽類血管緊張素Ⅱ受體AT1的拮抗藥,降壓效果好,不良反應(yīng)少,且有保護靶器官作用,臨床上廣泛用于高血壓的治療[1],厄貝沙坦服用后療效個體差異較大，臨床需注意個體化給藥。本文在反復(fù)比較文獻的基礎(chǔ)上，建立了人血漿中厄貝沙坦的HPLC-熒光檢測法，該法準確、靈敏度和特異性高，雜峰干擾少，可用于厄貝沙坦的藥代動力學(xué)和藥物相互作用的研究。
1 材料與儀器
1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀， 474熒光檢測器，515泵，Empower色譜數(shù)據(jù)工作站；SANYO低溫冰箱；ZH-2渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)；800型離心機(上海分析儀器廠)。
1.2 藥品與試劑 替米沙坦標準品(Lot No T-8949，美國Sigma-Aidrich公司)，厄貝沙坦標準品(批號：100607-200301，中國藥品生物制品檢定所)，厄貝沙坦片(賽諾菲安萬特杭州制藥有限公司，規(guī)格：0.15 g/片，批號：0A020)，試驗用水為多效蒸餾水，乙腈為色譜純，乙醚、二氯甲烷、磷酸為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件[2]色譜柱：Diamonsil C18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)，流動相：水:乙腈(57:43)，用磷酸調(diào)pH值為3.00，流速：1.0 ml/min，柱溫：室溫；熒光檢測波長：激發(fā)波長為254 nm，發(fā)射波長為371 nm[3]；內(nèi)標：替米沙坦；進樣量：50 μl；該色譜條件下厄貝沙坦和替米沙坦的保留時間分別為6.0 min 和4.2 min，厄貝沙坦和替米沙坦分離效果良好?？瞻籽獫{和加入內(nèi)標和標準品的血漿，按血漿樣品的處理方法處理后進樣。空白血漿的內(nèi)源性物質(zhì)對藥物和內(nèi)標物無干擾。見圖1。
圖1 厄貝沙坦的高效液相色譜圖
2.2 對照品溶液的配制 精密稱取(避光稱量)干燥至恒重的厄貝沙坦對照品，置于10 ml容量瓶中，加5 ml甲醇溶解，然后用蒸餾水定容至刻度，配成100 μg/ml儲備液，置4℃冰箱避光保存。臨用前用50%甲醇將厄貝沙坦儲備液按適當比例稀釋，制成濃度為10 μg/ml的厄貝沙坦對照品溶液。
2.3 內(nèi)標溶液的配制[4]精密稱取干燥至恒重的替米沙坦對照品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解，配成濃度為100 μg/ml的內(nèi)標儲備液，于4℃冰箱保存。臨用時取0.5 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋，得5 μg/ml的內(nèi)標溶液。
2.4 血漿樣品的處理[2]分別精密量取替米沙坦內(nèi)標溶液40 μl和人血漿400 μl，置于10 ml玻璃離心管中，渦旋混勻，加磷酸溶液(1 mol/L)100 μl，渦旋20 s，使其酸化，然后加乙醚-二氯甲烷(7∶3)[5]混合液5 ml，渦旋振蕩5 min提取，離心(1 500 r/min)5 min，取有機層5 ml于潔凈干燥具塞玻璃離心管中，加NaOH溶液(0.05 mol/L) 200 μl，渦旋震蕩3 min，離心(1 500 r/min)5 min，然后置于-80℃低溫冰箱中冷凍15 min，棄去上層有機相，待下層融化后，取150 μl于1 ml的Ephendroff管中，加磷酸溶液(0.2 mol/L)100 μl酸化，渦旋30 s，進樣50 μl分析。
2.5 標準曲線的制備 用人的空白血漿將100 μg/ml的厄貝沙坦儲備液配制成5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 μg/ml的系列標準曲線工作液。精密量取替米沙坦內(nèi)標溶液(5 μg/ml)40 μl置于10 ml具塞玻璃離心管中，分別加入400 μl上述系列濃度的標準工作液，按2.4項下進行血漿樣品處理，用HPLC-熒光檢測法測定，將厄貝沙坦峰面積與內(nèi)標峰面積的比值記為Y，厄貝沙坦?jié)舛葹閄，Y對X進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.0032+0.192X(r=0.9996)，結(jié)果表明：在0.05～5 μg/ml濃度范圍內(nèi)，厄貝沙坦峰面積與內(nèi)標峰面積的比值，與血漿中厄貝沙坦?jié)舛瘸柿己玫木€性關(guān)系，厄貝沙坦的最低檢測限為0.023 μg/ml(日內(nèi)RSD為3.21%，日間RSD為4.37%，n=5)。
2.6 精密度試驗 取空白血漿400 μl，按2.5項下方法分別配制濃度為4 000、800、80 ng/ml的高、中、低質(zhì)控血漿樣品 ，每一濃度5份，按上述血漿樣品處理方法處理，并測定各樣品的濃度，計算日內(nèi)RSD；連續(xù)測定5 d，計算日間RSD。見表1。
2.7 回收率試驗 取空白血漿400 μl，按2.5項下方法，分別配制濃度為4 000、800、80 ng/ml的高、中、低3種質(zhì)控血漿樣品，每一濃度5份，按上述血漿樣品處理方法處理，用HPLC-熒光檢測法測定。計算提取回收率和相對回收率，血漿樣品中厄貝沙坦峰面積與相同濃度標準對照品溶液峰面積的比值，為提取回收率；厄貝沙坦峰面積與替米沙坦內(nèi)標峰面積比值記為f，將f代入當日標準曲線求算血藥濃度，計算濃度與其真實濃度的比值，即為相對回收率。見表1。
表1精密度及回收率實驗結(jié)果
濃度(μg/ml)日間RSD(%)日內(nèi)RSD(%)提取回收率(%)方法回收率(%)44.214.3578.0±6.7101.2±6.30.80.944.4485.5±6.7102.2±5.30.087.286.4870.0±2.498.4±3.5
2.8 穩(wěn)定性考察試驗 取空白血漿400 μl，按2.5項下方法分別配制濃度為4 000、800、80 ng/ml的高、中、低3種質(zhì)控血漿樣品。將質(zhì)控血漿樣品分別反復(fù)凍融3次、置于-20℃冰箱中冷凍30 d和將血漿樣品處理后放置24 h，進行穩(wěn)定性考察。用測定值與理論值進行比較，計算相對誤差。反復(fù)凍融3次、于-20℃冰箱冷凍30 d和血漿樣品處理后放置24 h的RSD分別為5.93%～9.84%、1.62%～7.43%和4.27%～6.37%。表明血漿樣品經(jīng)反復(fù)凍融、放置均穩(wěn)定。每種穩(wěn)定性分別考察高、中、低3種質(zhì)控血漿樣品5份。
3 討論
提取、固相萃取和蛋白沉淀的樣品處理方法有文獻報道[6，7]。固相萃取法操作繁瑣而且成本較高。沉淀法雖然簡單，但靈敏度只有0.1 μg/ml，難以滿足厄貝沙坦的藥動學(xué)研究。本實驗選擇提取法。在提取法中， 我們分別考察了提取后冷凍和提取后揮干2種方法，其中提取后揮干法損失較冷凍法小，但是由于流動相對揮干后殘留物的復(fù)溶程度不佳，故測定值不穩(wěn)定，后又改用磷酸(0.2 mol/L)復(fù)溶，結(jié)果并未改善；本試驗采用比例為7∶3的乙醚和二氯甲烷有機溶液提取，后再用氫氧化鈉反提，然后冷凍、棄去有機相、酸化水相，濃縮和純化了樣品。并且冷凍后有機相位于上層，易于操作。本試驗建立的測定方法回收率高、靈敏度和特異性均較高，可用于厄貝沙坦的藥代動力學(xué)和藥物相互作用研究，為臨床個體化用藥提供技術(shù)支持。
1 Waeber B.A review of irbesartan in antihypertensive therapy: comparison with other antihypertensive agents.Current Therapeutic Research,2001,62:505-521.
2 周霞瑾，齊惠珍，牛哲哲，等.辛伐他汀對厄貝沙坦藥代動力學(xué)影響的研究.中國藥理學(xué)通報，2012,28：701-704.
3 Gonzalez L,Lopez JA,Alonso RM,et al.Fast screening method for the determination of angiotensin receptor antagonists in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection.J Chromatogr A,2002,949:49-60.
4 王明霞，侯娟，王敏，等.HPLC-熒光檢測法測定人血漿中替米沙坦的濃度的方法改進.中國藥房， 2007，18：1556-1557.
5 Shakya AK,Al-Hiari YM，Alhamami OM.Liquid chromatographic determination of irbesartan in human plasma.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,848:245.
6 王婉剛，劉啟明.HPLC-熒光檢測法測定人血漿中厄貝沙坦的濃度.中國藥房， 2007，18：2512-2513.
7 陳永玲，朱家壁，丁義華.HPLC法測定家兔血漿中厄貝沙坦的濃度.江蘇藥學(xué)與臨床研究， 2006,14：153-155.
10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.058
項目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(編號：20100443)
050011 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥劑科(周霞瑾、齊惠珍、張俊貞、王明霞)；河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(常青)
王明霞，050011 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院；
E-mail:mxia_wang@yahoo.com.cn
R 917
A
1002-7386(2014)11-1733-02
2014-01-11)
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周霞瑾 齊惠珍 張俊貞 王明霞 常青
·藥物研究·
HPLC-熒光法測定人血漿中厄貝沙坦?jié)舛?/p>
周霞瑾 齊惠珍 張俊貞 王明霞 常青
目的建立人血漿中厄貝沙坦?jié)舛鹊腍PLC-熒光測定方法。方法以替米沙坦為內(nèi)標，乙醚-二氯甲烷(7∶3)提取的方法處理血漿。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為水-乙腈(57∶43)，磷酸調(diào)pH值=3.00，熒光激發(fā)波長為254 nm，發(fā)射波長為371 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為室溫。進樣量50 μl。結(jié)果厄貝沙坦和替米沙坦的保留時間分別為6.1 min和4.3 min，在0.05～5 μg/ml范圍內(nèi)厄貝沙坦檢測濃度線性關(guān)系良好(r=0.9996)，最低檢測濃度為0.023 μg/ml。高、中、低3種濃度(4、0.8、0.08 μg/mL)的平均相對回收率分別為(101.18±6.31)%、(102.22±5.32)%、(98.45±3.52)%，提取回收率為(78.05±6.66)%，日間、日內(nèi)RSD均小于10%。樣品3次凍融及在-20℃冰箱長期放置穩(wěn)定性良好。結(jié)論本實驗建立的方法準確、靈敏度和特異性高，可用于厄貝沙坦的藥代動學(xué)和藥物相互作用研究
厄貝沙坦；替米沙坦；HPLC；熒光檢測法；血藥濃度
厄貝沙坦為一類新型的非肽類血管緊張素Ⅱ受體AT1的拮抗藥,降壓效果好,不良反應(yīng)少,且有保護靶器官作用,臨床上廣泛用于高血壓的治療[1],厄貝沙坦服用后療效個體差異較大，臨床需注意個體化給藥。本文在反復(fù)比較文獻的基礎(chǔ)上，建立了人血漿中厄貝沙坦的HPLC-熒光檢測法，該法準確、靈敏度和特異性高，雜峰干擾少，可用于厄貝沙坦的藥代動力學(xué)和藥物相互作用的研究。
1 材料與儀器
1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀， 474熒光檢測器，515泵，Empower色譜數(shù)據(jù)工作站；SANYO低溫冰箱；ZH-2渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)；800型離心機(上海分析儀器廠)。
1.2 藥品與試劑 替米沙坦標準品(Lot No T-8949，美國Sigma-Aidrich公司)，厄貝沙坦標準品(批號：100607-200301，中國藥品生物制品檢定所)，厄貝沙坦片(賽諾菲安萬特杭州制藥有限公司，規(guī)格：0.15 g/片，批號：0A020)，試驗用水為多效蒸餾水，乙腈為色譜純，乙醚、二氯甲烷、磷酸為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件[2]色譜柱：Diamonsil C18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)，流動相：水:乙腈(57:43)，用磷酸調(diào)pH值為3.00，流速：1.0 ml/min，柱溫：室溫；熒光檢測波長：激發(fā)波長為254 nm，發(fā)射波長為371 nm[3]；內(nèi)標：替米沙坦；進樣量：50 μl；該色譜條件下厄貝沙坦和替米沙坦的保留時間分別為6.0 min 和4.2 min，厄貝沙坦和替米沙坦分離效果良好?？瞻籽獫{和加入內(nèi)標和標準品的血漿，按血漿樣品的處理方法處理后進樣。空白血漿的內(nèi)源性物質(zhì)對藥物和內(nèi)標物無干擾。見圖1。
圖1 厄貝沙坦的高效液相色譜圖
2.2 對照品溶液的配制 精密稱取(避光稱量)干燥至恒重的厄貝沙坦對照品，置于10 ml容量瓶中，加5 ml甲醇溶解，然后用蒸餾水定容至刻度，配成100 μg/ml儲備液，置4℃冰箱避光保存。臨用前用50%甲醇將厄貝沙坦儲備液按適當比例稀釋，制成濃度為10 μg/ml的厄貝沙坦對照品溶液。
2.3 內(nèi)標溶液的配制[4]精密稱取干燥至恒重的替米沙坦對照品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解，配成濃度為100 μg/ml的內(nèi)標儲備液，于4℃冰箱保存。臨用時取0.5 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋，得5 μg/ml的內(nèi)標溶液。
2.4 血漿樣品的處理[2]分別精密量取替米沙坦內(nèi)標溶液40 μl和人血漿400 μl，置于10 ml玻璃離心管中，渦旋混勻，加磷酸溶液(1 mol/L)100 μl，渦旋20 s，使其酸化，然后加乙醚-二氯甲烷(7∶3)[5]混合液5 ml，渦旋振蕩5 min提取，離心(1 500 r/min)5 min，取有機層5 ml于潔凈干燥具塞玻璃離心管中，加NaOH溶液(0.05 mol/L) 200 μl，渦旋震蕩3 min，離心(1 500 r/min)5 min，然后置于-80℃低溫冰箱中冷凍15 min，棄去上層有機相，待下層融化后，取150 μl于1 ml的Ephendroff管中，加磷酸溶液(0.2 mol/L)100 μl酸化，渦旋30 s，進樣50 μl分析。
2.5 標準曲線的制備 用人的空白血漿將100 μg/ml的厄貝沙坦儲備液配制成5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 μg/ml的系列標準曲線工作液。精密量取替米沙坦內(nèi)標溶液(5 μg/ml)40 μl置于10 ml具塞玻璃離心管中，分別加入400 μl上述系列濃度的標準工作液，按2.4項下進行血漿樣品處理，用HPLC-熒光檢測法測定，將厄貝沙坦峰面積與內(nèi)標峰面積的比值記為Y，厄貝沙坦?jié)舛葹閄，Y對X進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.0032+0.192X(r=0.9996)，結(jié)果表明：在0.05～5 μg/ml濃度范圍內(nèi)，厄貝沙坦峰面積與內(nèi)標峰面積的比值，與血漿中厄貝沙坦?jié)舛瘸柿己玫木€性關(guān)系，厄貝沙坦的最低檢測限為0.023 μg/ml(日內(nèi)RSD為3.21%，日間RSD為4.37%，n=5)。
2.6 精密度試驗 取空白血漿400 μl，按2.5項下方法分別配制濃度為4 000、800、80 ng/ml的高、中、低質(zhì)控血漿樣品 ，每一濃度5份，按上述血漿樣品處理方法處理，并測定各樣品的濃度，計算日內(nèi)RSD；連續(xù)測定5 d，計算日間RSD。見表1。
2.7 回收率試驗 取空白血漿400 μl，按2.5項下方法，分別配制濃度為4 000、800、80 ng/ml的高、中、低3種質(zhì)控血漿樣品，每一濃度5份，按上述血漿樣品處理方法處理，用HPLC-熒光檢測法測定。計算提取回收率和相對回收率，血漿樣品中厄貝沙坦峰面積與相同濃度標準對照品溶液峰面積的比值，為提取回收率；厄貝沙坦峰面積與替米沙坦內(nèi)標峰面積比值記為f，將f代入當日標準曲線求算血藥濃度，計算濃度與其真實濃度的比值，即為相對回收率。見表1。
表1精密度及回收率實驗結(jié)果
濃度(μg/ml)日間RSD(%)日內(nèi)RSD(%)提取回收率(%)方法回收率(%)44.214.3578.0±6.7101.2±6.30.80.944.4485.5±6.7102.2±5.30.087.286.4870.0±2.498.4±3.5
2.8 穩(wěn)定性考察試驗 取空白血漿400 μl，按2.5項下方法分別配制濃度為4 000、800、80 ng/ml的高、中、低3種質(zhì)控血漿樣品。將質(zhì)控血漿樣品分別反復(fù)凍融3次、置于-20℃冰箱中冷凍30 d和將血漿樣品處理后放置24 h，進行穩(wěn)定性考察。用測定值與理論值進行比較，計算相對誤差。反復(fù)凍融3次、于-20℃冰箱冷凍30 d和血漿樣品處理后放置24 h的RSD分別為5.93%～9.84%、1.62%～7.43%和4.27%～6.37%。表明血漿樣品經(jīng)反復(fù)凍融、放置均穩(wěn)定。每種穩(wěn)定性分別考察高、中、低3種質(zhì)控血漿樣品5份。
3 討論
提取、固相萃取和蛋白沉淀的樣品處理方法有文獻報道[6，7]。固相萃取法操作繁瑣而且成本較高。沉淀法雖然簡單，但靈敏度只有0.1 μg/ml，難以滿足厄貝沙坦的藥動學(xué)研究。本實驗選擇提取法。在提取法中， 我們分別考察了提取后冷凍和提取后揮干2種方法，其中提取后揮干法損失較冷凍法小，但是由于流動相對揮干后殘留物的復(fù)溶程度不佳，故測定值不穩(wěn)定，后又改用磷酸(0.2 mol/L)復(fù)溶，結(jié)果并未改善；本試驗采用比例為7∶3的乙醚和二氯甲烷有機溶液提取，后再用氫氧化鈉反提，然后冷凍、棄去有機相、酸化水相，濃縮和純化了樣品。并且冷凍后有機相位于上層，易于操作。本試驗建立的測定方法回收率高、靈敏度和特異性均較高，可用于厄貝沙坦的藥代動力學(xué)和藥物相互作用研究，為臨床個體化用藥提供技術(shù)支持。
1 Waeber B.A review of irbesartan in antihypertensive therapy: comparison with other antihypertensive agents.Current Therapeutic Research,2001,62:505-521.
2 周霞瑾，齊惠珍，牛哲哲，等.辛伐他汀對厄貝沙坦藥代動力學(xué)影響的研究.中國藥理學(xué)通報，2012,28：701-704.
3 Gonzalez L,Lopez JA,Alonso RM,et al.Fast screening method for the determination of angiotensin receptor antagonists in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection.J Chromatogr A,2002,949:49-60.
4 王明霞，侯娟，王敏，等.HPLC-熒光檢測法測定人血漿中替米沙坦的濃度的方法改進.中國藥房， 2007，18：1556-1557.
5 Shakya AK,Al-Hiari YM，Alhamami OM.Liquid chromatographic determination of irbesartan in human plasma.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007,848:245.
6 王婉剛，劉啟明.HPLC-熒光檢測法測定人血漿中厄貝沙坦的濃度.中國藥房， 2007，18：2512-2513.
7 陳永玲，朱家壁，丁義華.HPLC法測定家兔血漿中厄貝沙坦的濃度.江蘇藥學(xué)與臨床研究， 2006,14：153-155.
10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.058
項目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(編號：20100443)
050011 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥劑科(周霞瑾、齊惠珍、張俊貞、王明霞)；河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(常青)
王明霞，050011 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院；
E-mail:mxia_wang@yahoo.com.cn
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1002-7386(2014)11-1733-02
2014-01-11)
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