白附片含藥血清對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究*

★ 許世兵 單樂天 金紅婷 童培建 肖魯偉

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053；2.浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是臨床最常見的骨關(guān)節(jié)病之一，其特征性是進(jìn)行性的軟骨退變，病變發(fā)展至晚期最終將導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失，臨床最終的治療選擇是關(guān)節(jié)假體置換。軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨中唯一一種細(xì)胞，其功能的異常是骨性關(guān)節(jié)炎變化的開始和關(guān)鍵[1]。軟骨細(xì)胞凋亡的增加、合成和分解代謝平衡的破壞均可造成軟骨細(xì)胞數(shù)量減少和軟骨基質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量減少和軟骨基質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)軟骨性能和力學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[2]。為進(jìn)一步明確其治療關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察中藥白附片對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響，以探討單味中藥對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變的治療作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gbico)、Ⅱ型膠原酶(Solarbio)、DMEM培養(yǎng)液(吉諾)、RPMI1640培養(yǎng)液(吉諾)、胎牛血清(FBS)、MTT(Solarbio)、DMSO(Sigma)

1.2 儀器 培養(yǎng)箱(Thermo)、潔凈工作臺(tái)(Airtech)、倒置相差顯微鏡(Olympus)、酶標(biāo)儀(Bio-tek)、臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、微量振蕩器(杭州亞美電子設(shè)備廠)、注射器針頭濾器0.22um濾膜、培養(yǎng)板(NEST)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。

1.3 藥物及其來源 白附片由浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠。1月齡雄性SD大鼠20只，體重(105±10)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)-2008-0016。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.4 血清采制方法 大鼠所用生藥劑量按照人與動(dòng)物千克體重?fù)Q算，白附片組按大鼠每千克體重用藥10g的劑量進(jìn)行換算灌胃；對(duì)照組灌服0.9%生理鹽水，1次/d，連續(xù)7d，末次灌胃(末次灌胃前禁食不禁水12h)2h后，麻醉動(dòng)物，心臟取血，靜置2小時(shí)后，3000r/min離心20min分離血清，56℃滅活30min，抽濾除菌后，分裝，-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要制備不同濃度的含藥血清。

1.5 軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 大鼠按水合氯醛0.3mL/100g，腹腔注射，麻醉。無菌條件下取健康一月齡大鼠的膝關(guān)節(jié)，剪碎至1mm×1mm×1mm大小，加入0.25%胰蛋白酶，置振蕩器上，37℃震蕩消化30min，消化后離心(1500r/min，5min)去上清，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶在37℃振蕩消化4h，每隔45min搖晃1次。將游離出的帶有酶溶液的軟骨細(xì)胞用吸管吸出，220目尼龍網(wǎng)過濾，離心，獲取軟骨細(xì)胞，將消化所得的細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清，100μ/mL青霉素，100μg/m1鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，按密度為1×105cells/mL接種于6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37℃，CO295%濕度)。48h后視細(xì)胞貼壁情況更換培養(yǎng)液，以后每2d更換培養(yǎng)液1次。

1.6 軟骨細(xì)胞的鑒定及形態(tài)學(xué)觀察 采用文獻(xiàn)報(bào)道[3]的甲苯胺藍(lán)染色的方法，將制備好的第3代細(xì)胞爬片，PBS漂洗3次，40g/L多聚甲醛固定30min，PBS漂洗2次，1%甲苯胺藍(lán)染色30min，自來水浸洗，無水乙醇迅速漂洗1次，干燥后中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.7 MTT法檢測(cè)中藥藥理血清對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響 第3代軟骨細(xì)胞消化后以3×104/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后去培養(yǎng)液，分別加入不同濃度白附片含藥血清(5%、10%、15%)每個(gè)濃度10個(gè)復(fù)孔；對(duì)照組予以空白血清干預(yù)，培養(yǎng)24，48，72h后分別加入MTT新鮮溶液(5mg/mL)，每孔20μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。4h后小心吸除上清，滴加150μL DMSO溶液，微量振蕩器上震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長測(cè)定各孔的吸光度(A)的值，讀取吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞的形態(tài)及鑒定 原代軟骨細(xì)胞呈圓球形,懸浮狀態(tài)，接種24h后可見大量的細(xì)胞貼壁，顯微鏡下圓形增大，伸張形成突起。早期細(xì)胞一般呈多角形，胞核為圓形或橢圓形，位于胞體中心，核仁為1～3個(gè)，致密程度和大小不等。胞體越大，核仁越清晰，胞核較穩(wěn)定。培養(yǎng)4d，可見細(xì)胞成簇現(xiàn)象，保持圓形或橢圓形生長狀態(tài)，且出現(xiàn)重疊生長現(xiàn)象。8d左右，細(xì)胞增殖逐漸融合形成單層，外觀呈典型“鋪路石”狀。原代、第2代、第3代細(xì)胞生長良好，增殖、分化及分泌基質(zhì)的能力強(qiáng)，細(xì)胞增殖速度快。第5代細(xì)胞體積開始變大，邊緣出現(xiàn)一些指狀突起，核也變大，胞膜和胞漿不清晰，增殖速度減慢，細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣。甲苯鞍藍(lán)染色能使酸性黏多糖異染成紅紫色，染色后細(xì)胞內(nèi)可見藍(lán)紫色異染顆粒，周圍有少量異染顆粒。見圖1～2。

圖1 軟骨細(xì)胞顯形態(tài)圖(×100)

圖2 軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色圖(×100)

2.2 白附片含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響

表1 MTT比色法檢測(cè)白附片含藥血清對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖(A)的影響

注：與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.01。

3 討論

3.1 骨性關(guān)節(jié)炎的病機(jī)與祛風(fēng)濕、止痹痛治法 中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為，“腎主骨生髓”，腎虛則筋骨不榮?！端貑枴ちK象論篇》曰：“腎者……,其充在骨?！薄端貑枴け园Y》、《諸病源候論·風(fēng)痹證》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹，其狀肌肉頑厚或疼痛”。膝骨性關(guān)節(jié)炎屬“骨痹”、“痛痹”范疇，乃風(fēng)寒濕邪合入所致，是氣滯血瘀、經(jīng)絡(luò)痹阻，本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證。其本是腎虛，標(biāo)是風(fēng)寒濕邪、痹阻經(jīng)絡(luò)，虛實(shí)夾雜之證則為肝腎虧損、血?dú)獠蛔?，夾雜風(fēng)寒濕邪痹阻經(jīng)絡(luò)；治本之法為補(bǔ)腎，治標(biāo)之法有祛風(fēng)散寒除濕、行氣活血、舒經(jīng)通絡(luò)，治虛實(shí)夾雜證則以益氣養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎、輔以祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)[4]。根據(jù)上述治法選用復(fù)方中藥對(duì)“骨痹”、“痛痹”證OA患者展開治療，結(jié)果表明對(duì)證中藥療效顯著。附子具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、補(bǔ)腎命火、逐風(fēng)祛濕散寒止痛之功效，常用于寒濕痹痛等證[5]。附子雖有毒，但歷來被醫(yī)家稱為藥中之圣藥、“回陽救逆第一品藥”，用于急、危、重癥，多能力挽狂瀾；施于慢性頑病痼疾，亦能起沉疴于須臾。正因?yàn)楦阶拥奶赜泄πВ瑥墓胖两?，一直被廣泛應(yīng)用于臨床。

3.2 MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖的原理 白附片對(duì)培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞影響的研究選用了MTT法測(cè)細(xì)胞活性及增殖能力。其特點(diǎn)是靈敏度高,重復(fù)性好,操作簡便,無放射性污染。MTT可被活細(xì)胞的線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的某些還原酶裂解成深藍(lán)色的甲瓚結(jié)晶。甲瓚的形成量與活細(xì)胞數(shù)目成正相關(guān)。而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長處測(cè)定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,與其它檢測(cè)細(xì)胞活力的方法有良好的相關(guān)性。

3.3 總結(jié)與展望 在本實(shí)驗(yàn)中，通過觀察對(duì)空白組、含藥血清組的比較，發(fā)現(xiàn)5%、10%、15%白附片含藥血清可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，對(duì)損傷的軟骨有一定的修復(fù)功能，可能是白附片在臨床上治療骨性關(guān)節(jié)炎具有較好效果的部分機(jī)理，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究，為臨床療效提供理論依據(jù)。

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[4]江蓉星,熊華,金桂花.骨性關(guān)節(jié)炎的臨床治療研究概況[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,2003,11(1):57-58.

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