四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型比較*

★ 徐彭 談偉鋒 劉波* 謝珍 曹怡 周年

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江西 南昌 330004)

復(fù)制合適的穩(wěn)定的肝損傷動(dòng)物模型是尋找肝損傷治療藥物的前提。目前對(duì)于肝損傷模型主要由化學(xué)性、免疫性、藥物、酒精等物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生[1,2]。四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)是常見的外源性化合物[3]，能產(chǎn)生肝損傷并被用于研究藥物的防治作用。蘭鳳英等[4]以0.2%的CCl4油溶液復(fù)制小鼠急性肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)郁金能抗CCl4致小鼠急性肝損傷的作用。寧康健等[5]采用0.1% CCl4油溶液復(fù)制小鼠肝損傷模型研究黃芩苷對(duì)小鼠肝損傷的保護(hù)研究。此外，也有學(xué)者以不同濃度的CCl4復(fù)制出小鼠肝損傷模型用于保肝藥的研究[6,7]。但是，由于復(fù)制動(dòng)物模型所用CCl4油溶液的濃度、藥方式和給藥時(shí)間不同,導(dǎo)致小鼠肝損傷類型不同，表現(xiàn)多種多樣，缺乏穩(wěn)定性。因此，選擇穩(wěn)定、有效的CCl4致小鼠肝損傷模型的復(fù)制方法是開展實(shí)驗(yàn)研究的重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠120只，雌雄各半，SPF級(jí)，體重18～22g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證編號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 藥物與試劑 AST、ALT檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20120719和20120719)；CCl4溶液(汕頭市隴西化工廠有限公司，許可證編號(hào)：XK13-201-00153)；金龍魚特香花生油(江西省南昌市新建縣歐尚超市，商品編號(hào)1005703882)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 UV-2102C型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼科上海儀器有限公司)，超聲波清洗器SK5200LH(上?？茖?dǎo))，BS124S分析天平 (Sartorius)，YP202N電子天平(上海精密儀器有限公司)，手動(dòng)轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(Leica)，H-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腹腔注射給藥誘導(dǎo)小鼠肝損傷 健康昆明小鼠40只，隨機(jī)分成4組，即正常組、CCl4高劑量組、CCl4中劑量組、CCl4低劑量組。采用腹腔注射的方式，分別注射生理鹽水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的1% CCl4油溶液(油為食用植物油)，給藥24 h。

1.2.2 皮下注射給藥誘導(dǎo)小鼠肝損傷 健康昆明小鼠40只，隨機(jī)分成4組，即正常組、CCl4高劑量組、CCl4中劑量組、CCl4低劑量組。采用皮下注射的方式，分別注射生理鹽水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的0.2% CCl4油溶液(油為食用植物油)，隔天給藥，連續(xù)給藥14 d。

1.2.3 灌胃給藥誘導(dǎo)小鼠肝損傷 實(shí)驗(yàn)取雌雄各半、體重18～22 g健康昆明小鼠40只，飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成雌雄各半4組，即正常組、CCl4高劑量組、CCl4中劑量組、CCl4低劑量組。采用灌胃給藥方式，分別灌胃蒸餾水、11 mL/kg、10 mL/kg 和9 mL/kg 的0.2% CCl4油溶液(油為食用植物油)，每隔48小時(shí)給藥，連續(xù)給藥90 d。

1.2.4 血清AST、ALT活性檢測(cè) 分別在24 h、14 d、90 d時(shí)，眼眶取血，并離心獲取血清，采用比色法測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(所有步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行)。

1.2.5 肝組織病理學(xué)檢查 分別在24 h、14 d、90 d時(shí)，脫頸處死動(dòng)物，取肝臟，并以10%多聚甲醛固定肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)過80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇脫水透明后進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片，片厚4μm。鋪片和烘片后用二甲苯脫蠟，脫苯、復(fù)水、染色、脫水、透明、封固。二甲苯浸泡2次各5min，然后逐層乙醇復(fù)水：無水乙醇I 2min，無水乙醇II 2min，95%乙醇I 2min，95%乙醇II 2min，80%乙醇2min，75%乙醇2min 。蒸餾水洗1min接著蘇木素染色5min然后自來水輕輕沖洗1min反藍(lán)，1%鹽酸乙醇分化30s，自來水浸泡7min；放置伊紅液中2min，無水乙醇I2min，無水乙醇II2min，二甲苯I4min，二甲苯II4min。待切片干后，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射誘導(dǎo)急性肝損傷動(dòng)物模型的復(fù)制

表1 不同濃度的CCl4腹腔注射對(duì)肝組織操作的影響

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01，以下均同。

表2 不同濃度的CCl4皮下注射對(duì)肝組織損傷的影響

由表1可見，不同濃度的CCl4腹腔注射均可產(chǎn)生急性肝損傷，使血清ALT明顯升高，但只有高劑量才能升高AST。

2.2 皮下注射誘導(dǎo)亞急性肝損傷動(dòng)物模型的復(fù)制

由表2可見，不同濃度的CCl4皮下注射均可產(chǎn)生亞急性肝損傷，只有CCl4中劑量不僅可使血清ALT明顯升高，還能升高AST。

2.3 灌胃給藥誘導(dǎo)慢性肝損傷動(dòng)物模型的復(fù)制

表3 不同濃度的CCl4灌胃對(duì)肝組織損傷的影響

表3顯示，不同濃度的CCl4灌胃給藥均可產(chǎn)生肝損傷，CCl4各劑量不僅可使血清ALT明顯升高，還能升高AST，作用穩(wěn)定，且呈濃度依賴性。

2.4 CCl4不同給藥途徑對(duì)肝組織形態(tài)的影響

圖1顯示，腹腔注射CCl4高、中、低劑量均能造成小鼠肝損傷，肝損傷較為嚴(yán)重，損傷區(qū)域呈帶狀壞死并伴有嚴(yán)重的脂肪性病變，且各組間區(qū)別不明顯。皮下注射CCl4高、中、低劑量均能造成小鼠肝損傷，其中CCl4高劑量造成的小鼠肝損傷較為嚴(yán)重，損傷區(qū)域成帶狀壞死并伴脂肪性病變， CCl4中、低劑量造成小鼠肝損傷與CCl4高劑量相比帶狀壞死較少，多呈小區(qū)域肝細(xì)胞壞死并伴隨炎細(xì)胞浸潤，壞死區(qū)域有較多的肝細(xì)胞細(xì)胞核破裂溶解。灌胃CCl4高、中、低劑量也能造成小鼠肝損傷，CCl4高、中、低劑量誘導(dǎo)肝損傷呈肝細(xì)胞變性，其中高劑量誘導(dǎo)的肝損傷區(qū)域有大量的肝細(xì)胞壞死并伴肝細(xì)胞脂肪樣變性，損傷區(qū)域有大量的炎性細(xì)胞浸潤，周圍的肝細(xì)胞細(xì)胞核固縮、溶解。中劑量誘導(dǎo)的肝損傷區(qū)域有極少量的肝細(xì)胞壞死并伴有肝細(xì)胞脂肪樣變性，損傷區(qū)域有炎性細(xì)胞浸潤，周圍的肝細(xì)胞核固縮，溶解。低劑量誘導(dǎo)的肝損傷程度較輕，僅有部分區(qū)域的肝細(xì)胞細(xì)胞核固縮、溶解伴有少量的炎性細(xì)胞浸潤。

A.正常組；B.腹腔注射CCl4高劑量組；C.腹腔注射CCl4中劑量組；D.腹腔注射CCl4低劑量組；E.皮下注射CCl4高劑量組；F.皮下注射CCl4中劑量組；G.皮下注射CCl4低劑量組；H.灌胃CCl4高劑量組；I.灌胃CCl4中劑量組；J.灌胃CCl4低劑量組

3 討論

CCl4引起肝細(xì)胞損傷時(shí)，破壞膜的結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞內(nèi)的多種酶可透過肝細(xì)胞膜到肝竇狀隙進(jìn)入血液，使血中的多種酶活性增高[7]。ALT與AST主要分布在肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)。肝細(xì)胞壞死時(shí)ALT和AST活性升高。其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致，是目前最常用的肝功能指標(biāo)[8]。AST和ALT在肝細(xì)胞分布不同，其中ALT主要分布在肝細(xì)胞漿，AST主要分布在肝細(xì)胞漿和肝細(xì)胞的線粒體中。急性肝炎和慢性肝炎輕型，雖有肝細(xì)胞的損傷，肝細(xì)胞的線粒體仍保持完整，故釋放入血的只有存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的ALT，主要表現(xiàn)為ALT升高。重型肝炎和慢性肝炎的中型和重型，或肝硬化、肝癌，肝細(xì)胞線粒體遭到嚴(yán)重破壞，AST從線粒體和胞漿內(nèi)釋出，表現(xiàn)AST活性明顯升高[9，10]。本研究顯示急性、亞急性CCl4肝損傷組的ALT與正常組相比存在顯著性差異，而AST與正常組相比并無顯著性差異。說明CCl4急性和亞急性組的肝細(xì)胞雖然受到嚴(yán)重破壞，但是肝細(xì)胞中的線粒體并沒有受到嚴(yán)重的破壞。而CCl4所致慢性肝損傷模型不僅能升高ALT,并且升高AST,濃度存在依賴性，說明肝細(xì)胞不僅細(xì)胞膜被破壞，肝細(xì)胞中的線粒體也受到了破壞，造模相對(duì)穩(wěn)定，因此長(zhǎng)時(shí)間灌胃CCl4最有利于小鼠慢性肝損傷模型的復(fù)制。

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