加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片的質(zhì)量控制研究*

★ 樓婷婷 陳佳麗 袁強

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005)

加減四君子湯(JJSJZT)主要由人參、白術(shù)、茯苓、甘草、白芍、白花蛇舌草組成，臨床主要用于治療消化系統(tǒng)疾病，如慢性胃炎[1]、胃潰瘍[2]、十二指腸球部潰瘍[3]、胃竇炎、胃腸功能減退[4]等，加減四君子湯能一定程度抑制胃癌與癌前病變的發(fā)生[5]。本文根據(jù)各種藥物的有效部位及成分性質(zhì)分別采用相應(yīng)工藝條件提取，使其在充分發(fā)揮保留有效成分及保證療效的前提下提高了用藥效率。已有的研究表明[6-8]，胃內(nèi)漂浮片可延長藥物在胃內(nèi)的滯留時間，并持續(xù)均勻釋放所載藥物，延長藥物釋放時間，改善藥物吸收，提高生物利用度，使療效得到改善，故選擇胃內(nèi)漂浮片為本藥劑型。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀；紫外可見分光光度計UV-2550(日本島津公司)；KQ5200超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(德國塞多利斯)；R204型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 乙腈為色譜純(美國TEDIA公司)，水為過0.2μm濾膜的純水，甲醇、乙醇、正丁醇等其他試劑均為分析純，購自華東化工儀器試劑有限公司。

1.2.2 對照品 人參皂苷Rb1對照品(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110704-200921)；人參皂苷Rg1對照品(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110703-200726)；人參皂苷Re對照品(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110754-200822)；芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110736-201035)；D-無水葡萄糖(中國藥品生物制品檢定所，含測用，批號：110833-200503)；人參對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：120917-200609)。

1.2.3 試藥 三批加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片(自制)；人參、白芍等藥材均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋捷民教授鑒定合格。

2 方法[9-12]與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 人參的鑒別 取本品粉末5g，加甲醇30mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加10mL水使溶解，用水飽和正丁醇萃取3次(15,10,10mL)，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。吸取人參皂苷Rg1、Re、Rb1溶液，對照藥材溶液，藥材溶液，供試品溶液，陰性對照溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(32∶11∶2)為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果見圖1。

2.1.2 白芍的鑒別 取本品粉末5g，加乙醇50mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加10mL水使溶解，用水飽和正丁醇萃取3次(15,10,10mL)，合并萃取液蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。吸取芍藥苷溶液，白芍藥材溶液，供試品溶液，陰性對照溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果見圖2。

1.人參皂苷；2.人參對照藥材；3. 人參藥材；4.胃內(nèi)漂浮片樣品；5.陰性(缺人參藥材)

1.芍藥苷；2.白芍藥材；3、4. 胃內(nèi)漂浮片樣品；5.陰性(缺白芍藥材)

2.2 含量測定

2.2.1 HPLC法測定制劑中人參皂苷、芍藥苷的含量

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18(4.6mm ×250mm，5μm)；檢測波長：人參皂苷203nm，芍藥苷230nm；柱溫：人參皂苷30℃，芍藥苷25℃；流速：均為1.0 mL/min；流動相：人參皂苷為(0～10 min，乙腈-水為19∶81；10～40min，19～29乙腈；40～45 min，29～31 乙腈；45～60min，31～37乙腈)、芍藥苷為乙腈-水為14∶86；進樣量：10 μL。

2.2.1.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取人參皂苷和芍藥苷對照品溶液適量注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定人參皂苷和芍藥苷峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。計算回歸方程分別為：Rg1：Y=376527.6801X-321.0534，r=1.0000；Re：Y=328135.4893X-569.1802，r=1.0000；Rb1：Y=272196.5638X+2797.8999，r=1.0000；芍藥苷：Y=1335381.6741X-10139.8343，r=1.0000。表明人參皂苷Rg1在0.284～2.272μg，人參皂苷Re在0.432～3.456μg，人參皂苷Rb1在0.716～5.728μg，芍藥苷在0.284～2.272μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，重復(fù)進樣5次，每次10μL，測定峰面積，計算RSD。得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.44%，0.39%，0.89%，0.92%，表明測定儀器的精密度良好。

2.2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0, 2, 4, 6, 8, 12h進行測定，計算供試品溶液人參皂苷和芍藥苷的峰面積RSD。得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、芍藥苷峰面積的RSD分別為1.7%，2.8%，1.7%，3.0%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.1.5 重復(fù)性試驗 稱取同一批次樣品6份，按供試品溶液制備方法制備供試液，精密吸取10μL進樣，照上述色譜條件進行測定，計算供試品溶液人參皂苷和芍藥苷的含量RSD。試驗結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1、芍藥苷含量的RSD分別為2.6%，2.9%，2.4%，2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.1.6 加樣回收率試驗 取已知人參皂苷和芍藥苷含量的樣品，分別加入一定濃度的對照品混合溶液0.8mL、1.0mL、1.2mL，按供試品溶液的制備方法制備，精密吸取10μL進樣，測定人參皂苷和芍藥苷峰面積，計算加樣回收率。得人參皂苷Rg1、Re、Rb1、芍藥苷的加樣回收率分別為101.7%、 102.4 %、100.9%、101.8%。

2.2.1.7 樣品的測定 取三批樣品按供試品溶液的制備方法分別制備供試液，測定加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片中人參皂苷和芍藥苷的含量。結(jié)果顯示三批制劑的人參皂苷平均含量為3.542mg/g，芍藥苷平均含量為3.546mg/g，故規(guī)定加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片中人參皂苷的含量限度為2.834mg/g，芍藥苷的含量限度為2.837mg/g。

2.2.2 紫外分光光度法測定制劑中總多糖含量

據(jù)文獻報道，多糖成分具有免疫調(diào)節(jié)作用，能起到治療慢性萎縮性胃炎的作用[13,14]。測定多糖含量常采用紫外可見分光光度法，經(jīng)預(yù)試驗證明采用苯酚-硫酸法測定多糖含量靈敏度高且重復(fù)性好，故將其作為該制劑質(zhì)量的評價指標之一。

2.2.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取稀釋后的的葡萄糖對照品母液0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.2mL，置于干燥的15mL具塞試管中，各加蒸餾水至2.0mL后，精密加入5%苯酚試劑1.0mL，濃硫酸5.0mL，搖勻，置沸水浴中加熱15min，取出置冷水中涼至室溫；精密吸取2.0mL蒸餾水置于干燥的15mL具塞試管中，同法操作為空白，在489.0nm處測定吸光度，繪制標準曲線。得回歸方程：Y=0.0086X-0.026，r=0.9998。表明葡萄糖在16.328～97.968μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液2.0mL，按線性關(guān)系考察項下方法操作，重復(fù)測定5次，記錄吸光度，計算RSD。試驗結(jié)果顯示供試品溶液吸光度均值為0.442，RSD為2.2%，表明儀器的精密度良好。

2.2.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液2.0mL，按線性關(guān)系考察項下方法操作，每10min測定1次，1h后改為每30min測1次，記錄吸光度，計算RSD。測得吸光度在180min之內(nèi)保持穩(wěn)定，RSD為0.25%。故各樣品吸光度的測定均在180min內(nèi)完成。

2.2.2.4 重復(fù)性試驗 取同一批號樣品按供試品溶液的制備方法制備6份。按線性關(guān)系考察項下方法操作測定吸光度，計算RSD。計算多糖含量RSD為3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.2.5 加樣回收率試驗 取已知多糖含量的樣品6份，分別精密加入1.56mg/mL葡萄糖對照品溶液1mL，按供試品溶液制備方法制備，測定供試液中多糖含量，計算加樣回收率。測得供試液中多糖平均加樣回收率為100.5%，RSD為2.6%。

取三批樣品，按供試品溶液的制備方法分別制備供試液，按線性關(guān)系考察項下方法操作，測定加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片中總多糖的含量。三批制劑的平均含量為132.6mg/g，故規(guī)定加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片中多糖的含量限度為106.1mg/g。

3 討論

3.1 本試驗從定性鑒別、含量測定兩方面建立了加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片的質(zhì)量控制方法，方法專屬性強、靈敏、可靠。

3.2 采用薄層色譜法建立了人參、白芍的定性鑒別。薄層色譜斑點清晰，分離效果好，陰性對照無干擾，方法靈敏、可靠、專屬性強。

3.3 加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片中人參為君藥，人參皂苷是其主要有效成分，常被用來作為人參制劑的定量指標；白芍為處方增加的藥味，芍藥苷是其主要有效成分；總多糖是本處方制劑的主要有效成分之一，因此質(zhì)量控制方法中的含量測定主要以人參皂苷Rg1、Re、Rb1及芍藥苷、總多糖為考察指標進行。采用HPLC法對人參皂苷、芍藥苷進行含量測定，結(jié)果樣品分離效果理想，陰性空白不干擾測定，采用UV顯色法對總多糖含量進行檢測，

本試驗只對三批樣品進行了含量測定，取三批樣品平均值下浮20%作為含量限度。經(jīng)過方法學(xué)考察表明，制定的測定方法重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性均良好，回收率符合要求。實驗制備的加減四君子湯胃內(nèi)漂浮片符合2010版《中國藥典》[15]對片劑所做的規(guī)定，質(zhì)量穩(wěn)定可控，能保證用藥的安全、有效。

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