細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑研究現(xiàn)狀

王禮興　張均平　王明席等

[摘要] 目前普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，腫瘤產(chǎn)生的本質(zhì)是細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)失控，而細(xì)胞的增殖要通過(guò)細(xì)胞周期來(lái)調(diào)控。細(xì)胞周期調(diào)控激酶復(fù)合物[cyclin dependent kinase（CDK）/Cyclin]活性的異常是導(dǎo)致細(xì)胞周期失控的根本原因。抑制CDK/Cyclin激酶的活性成為有效治療腫瘤的策略之一。因此，針對(duì)CDK/Cyclin激酶抑制劑的研究是當(dāng)前抗腫瘤藥物開發(fā)的熱點(diǎn)之一。本文對(duì)近年來(lái)CDK/cyclin抑制劑的種類及目前其在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行概述。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑；腫瘤；細(xì)胞周期

[中圖分類號(hào)] R979.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）13-44-04

[Abstract] As normally accepted， the cell proliferation is regulated through cell cycle and the occurrence of tumor may lie in deregulation of cell cycle， directly resulted from the abnormal of the complex of cyclin dependent kinase（CDK）.It has become one of the most effective strategies to inhibit the activity of the complex for dealing with tumors.Thus，the study on CDK/Cylclin complex inhibitors is one of hot focuses in antitumor drug discovery.This thesis mainly discusses the types of CDK/Cyclin inhibitors and their clinical issues.

[Key words] Inhibitor；Cancer；Cell cycle

細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程是在檢查點(diǎn)的監(jiān)視下，各種調(diào)控因子依次激活或滅活，從而啟動(dòng)細(xì)胞完成DNA復(fù)制，分裂為2個(gè)子代細(xì)胞的過(guò)程。在諸多細(xì)胞周期調(diào)控因子中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）是處于核心位置，其與細(xì)胞周期蛋白Cyclins、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKIs）等組成細(xì)胞周期調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[1]。CDKs是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，目前有13種包括CDK1～13，分別在細(xì)胞周期調(diào)控CDKs（1～6）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控CDKs（7～13）起作用。細(xì)胞周期的調(diào)控事實(shí)上就是檢查點(diǎn)的調(diào)控，其中以G1/S調(diào)控點(diǎn)最為重要。細(xì)胞周期受到外界信號(hào)如生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，催化亞基CDK4/CDK6與調(diào)節(jié)亞基CyclinD結(jié)合后，CDKs殘基被磷酸化/去磷酸化修飾而被激活，CDKs激活后催化Rb蛋白使之磷酸化，Rb基因（retinob lastoma gene）又稱為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因，是第一個(gè)被克隆的抑癌基因，其蛋白磷酸化后與轉(zhuǎn)錄因子（如E2F）形成復(fù)合物的能力喪失，E2F在細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用，能誘導(dǎo)CyclinE和CDK2的表達(dá)并形成CyclinE/CDK2復(fù)合體，后者進(jìn)一步使Rb蛋白磷酸化，充分釋放E2F，隨后E2F進(jìn)入核內(nèi)激活一系列細(xì)胞周期進(jìn)入S期的必須基因的表達(dá)。在S期內(nèi)DNA復(fù)制晚期，CDK2被cyclinA激活，使轉(zhuǎn)錄因子E2F及時(shí)失活，阻止了由持續(xù)激活的E2F導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[2-3]。

1 CDK/Cyclin抑制劑的種類

研究統(tǒng)計(jì)顯示，有超過(guò)90%的人類癌癥中CDK、Cyclin、CKI和Rb途徑中相關(guān)基因發(fā)生了變異，其中CDK和其相應(yīng)的調(diào)節(jié)亞基Cyclin的失常最為頻繁[2-3]。此外，細(xì)胞周期的波動(dòng)促進(jìn)了化療的抗性，降低了化療的效果。因此恢復(fù)細(xì)胞周期正常的CDK/Cyclin活性調(diào)控是治療腫瘤的策略之一。藥物研究人員已經(jīng)把尋找不同類型CDK和Cyclin抑制劑作為前沿的抗腫瘤藥物的重點(diǎn)研究方向。目前CDK抑制劑主要有內(nèi)源性的和外源性的兩種。

1.1 內(nèi)源性小分子抑制劑

1.1.1 小分子量蛋白 內(nèi)源性小分子抑制劑中最大的一類是低分子量蛋白質(zhì)，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的差異分為兩大類：一類稱雙重特異家族INK4，包括p15，p16，p18，p19，該蛋白家族可抑制cyclin D相關(guān)激酶的活性，其抑制作用依賴蛋白與相應(yīng)的游離CDK4結(jié)合，從而阻斷CDK4與相應(yīng)cyclin D結(jié)合形成具有催化功能的二聚體復(fù)合物。另一類叫Kip家族，包括p21，p27，p57，該蛋白家族可以和cyclin E/CDK2與cyclinA/CDK1組成的二聚體復(fù)合物再組成三聚體，通過(guò)封閉二聚體的催化活性中心從而發(fā)揮其抑制作用這些內(nèi)源性抑制因子與激酶復(fù)合物結(jié)合后，可特異性地調(diào)節(jié)其活性，從而精確調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化過(guò)程，內(nèi)源性CDK調(diào)節(jié)劑的存在不僅提示細(xì)胞本身的分裂、增殖具有精密的調(diào)控機(jī)制，而且也反應(yīng)了該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要作用與地位[1-5]。研究表明，多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與CDKs/cyclins的過(guò)度表達(dá)或其內(nèi)源性抑制因子表達(dá)下降有關(guān)，如p16的缺失與小細(xì)胞和黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生密切聯(lián)系[4-7]；p27蛋白的缺失常見于乳癌，前列腺癌，結(jié)腸癌以及消化道腫瘤[8-12]。因此，內(nèi)源性CDKs抑制因子的缺失或基因突變是腫瘤診斷的重要參考指標(biāo)。

1.1.2 非編碼小RNA 內(nèi)源性小分子抑制劑還有一類是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類重要的非編碼RNA——microRNA，MicroRNA是一種長(zhǎng)度在21～23nt的非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA 3UTR區(qū)的靶位點(diǎn)區(qū)域相互結(jié)合而快速有效地降解mRNA或抑制蛋白的翻譯，將蛋白控制在生命活動(dòng)所需的較低或最佳的水平上。已發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞周期調(diào)控的microRNA已有10余種，其中miR-1-2與miR-34分別靶向CDK4，細(xì)胞周期被停滯于G1期，近而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13-15]；miR-22靶向CDK6細(xì)胞周期停滯于G1期，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞衰老。在不同的生物學(xué)過(guò)程中，這些miRNA通過(guò)靶向E2F、CDK、cyclin、p21、p27、DNA多聚酶α等促進(jìn)或阻滯細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。endprint

1.2 外源性小分子抑制劑

外源性的抑制劑包括反義核酸、抗體、小分子RNA干擾（siRNA）和小分子化合物四種。小分子化合物是最主要的一類外源性CDK抑制劑。

1.2.1 小分子化合物 近幾年來(lái)，由于對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的了解允許人們進(jìn)行分子模擬研究，在設(shè)計(jì)開發(fā)高效、有選擇性的CDKs化學(xué)抑制劑的研究方面取得了突破性進(jìn)展，可以說(shuō)這類化合物每天都有新的成員在增加[15-17]。目前小分子CDK抑制劑可分為以下13類：（1）嘌呤類（Roscovitine and Olomoucin）、（2）嘧啶類（PD-033299）、（3）黃酮類（Flavopiridols）、（4）噻唑類（SNS-03）、（5）吲哚類及其衍生物（SU951）、（6）哌酮類（Paullones）、（7）咪唑并吡啶、吡唑并吡啶類（AZ703），（8）吡嗪類（AT751）、（9）丁酸內(nèi)酯類（butyrolactone-1），（10）十字苞堿類（UCN-01）等13種，其中發(fā)展較快的為嘌呤類、嘧啶類、氨基噻唑類、黃酮類、吲哚咔唑類似物、Paullones、靛玉紅及其衍生物和吡嗪類。已有13個(gè)小分子抑制劑進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。它們都是平面雜環(huán)的小分子化學(xué)物，與ATP競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合在CDK激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)上。如Seliciclib[CYC202，（R）-roscovitine]是一個(gè)2，6，9-三元取代的嘌呤類似物，選擇性抑制CDKs/Cyclins，尤其是對(duì)CDK2/cyclinE的抑制作用最強(qiáng)。在體外對(duì)激酶活性的影響IC50值分別為CDK1/cyclinB（2.69μM）、CDK2/cyclinA（0.71μM）、CDK2/cyclinE（0.10μM）、CDK4/cyclinD1（14.21μM）、CDK7/cyclinH（0.49μM）、ERK-2（1.17μM）、PKA>50μM、PKC>100μM和SAPK>20μM。在體外，CYC202對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞株的增殖有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等。IC50值范圍是7.9～30.2μM，在24h，達(dá)到80%凋亡率時(shí)，CYC202濃度是20μM。對(duì)正常細(xì)胞的毒性明顯低于對(duì)癌細(xì)胞的毒性，IC50在22.2～100μM這個(gè)范圍。CYC202能抑制凋亡抑制基因的表達(dá)，通過(guò)抑制MDM2的表達(dá)，阻滯p53的降解，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯G1/S與G2/M期，降低pRb的磷酸化水平，誘導(dǎo)細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，CYC202耐藥性好，口服生理活性良好，對(duì)由人結(jié)腸癌、子宮癌細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)的實(shí)體瘤有明顯的抑制作用。CYC202正在進(jìn)行2個(gè)Ib期劑量增加的臨床實(shí)驗(yàn)，在Ib期研究中發(fā)現(xiàn)，10例患有卵巢癌的患者服用CYC2024個(gè)月以上，腫瘤沒有增加和嚴(yán)重的治療相關(guān)的副作用，其中1個(gè)患者的腫瘤縮小了30%以上，治療1年以上的患者病情穩(wěn)定。Ⅱ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，CYC202單獨(dú)應(yīng)用效果稍差，與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療效果顯著。CYC202聯(lián)合卡培他濱治療乳腺癌，聯(lián)合2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷或順鉑治療肺癌、鼻咽癌的IIb期臨床實(shí)驗(yàn)也在進(jìn)行[18-24]。

1.2.2 小分子RNA干擾 小分子RNA干擾技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使特異性的干預(yù)靶分子的基因表達(dá)的研究成為可能，有不少科學(xué)家開始從基因水平干預(yù)CDK/Cyclin的合成。Lima等[25-26]將靶向CyclinE的siRNA轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞Hep3B、HepG2、SNU449（CyclinE過(guò)表達(dá)），HuH7（CyclinE沒有過(guò)表達(dá)）后發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)CyclinE的細(xì)胞中，CyclinE的表達(dá)下降了90%，DNA合成明顯下降，細(xì)胞發(fā)生凋亡。Galimberti等[27]將分別靶向CyclinE、CDK2、CDK1的siRNA轉(zhuǎn)染鼠肺癌細(xì)胞HOP-62、H-522、H-23后，發(fā)現(xiàn)CyclinE/CDK2能引起細(xì)胞凋亡，抑制肺癌細(xì)胞的增殖，而CDK1siRNA對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響。CDK1 siRNA干擾導(dǎo)致的CDK1表達(dá)降低只引起細(xì)胞期阻滯，細(xì)胞增殖減慢；而CDK1和CDK2 siRNA的共同干擾作用導(dǎo)致的CDK1、CDK2表達(dá)同時(shí)降低，引起細(xì)胞周期S期和G2/M期的阻滯，同時(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。曹銀芳等[28]成功將靶向CDK2/CyclinE的siRNA重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)CDK2和CyclinE mRNA表達(dá)顯著下降，細(xì)胞周期停滯于S期發(fā)生阻滯，G1期細(xì)胞明顯增多，Caspase-3活性增強(qiáng)，HepG2細(xì)胞發(fā)生了凋亡，并且細(xì)胞周期的改變與轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞體外增殖力下降是一致的。

2 問(wèn)題與展望

CDK1，CDK2，CDK4，CDK6是熱門的抗癌靶標(biāo)，但由于激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)高度的保守性，選擇性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)與開發(fā)是一個(gè)公認(rèn)的難題。因激酶結(jié)構(gòu)的保守性而產(chǎn)生的耐藥性和毒副作用，嚴(yán)重阻斷了化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)，限制和影響了治療的效果。研究發(fā)現(xiàn)CDKs/Cylcins抑制劑的臨床應(yīng)用出現(xiàn)的最大問(wèn)題是腫瘤的耐藥性導(dǎo)致了腫瘤的復(fù)發(fā)，療效明顯降低。其抗性的產(chǎn)生與該致癌激酶基因的擴(kuò)增、補(bǔ)充途徑及信號(hào)通路的反饋調(diào)節(jié)相關(guān)。此外，其抗性還與藥物靶點(diǎn)的單一或群體突變有關(guān)，導(dǎo)致了藥物與靶點(diǎn)的親和性差。

siRNA藥物誘導(dǎo)的RNAi具有特異性和高效性，是對(duì)成癮性致癌基因?qū)嵤┌邢蛑委煹睦硐脒x擇。研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物與siRNA聯(lián)合作用于腫瘤細(xì)胞，具有協(xié)同作用，基因治療可作為化學(xué)治療藥物外的補(bǔ)充途徑。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)，用livin-siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致livin基因沉默后，可激活caspase-3并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)紫外線等其他促凋亡刺激信號(hào)的敏感性。用RNAi技術(shù)下調(diào)bcl-2或XIAP基因表達(dá)，可增加人乳腺癌細(xì)胞MCF-7依托泊苷及阿霉素的敏感性，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞的數(shù)量與活性下降、凋亡率增加，較單一化療藥物處理組活性細(xì)胞數(shù)目明顯減少。Chistiane等[30]將針對(duì)多藥耐藥基因MDR1編碼的P-gp-siRNA轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞EPP85-181RDB和人胃癌細(xì)胞EPG85-257RDB，發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的耐藥性分別下降了89%和58%。具有MDR特性的K562細(xì)胞經(jīng)上述siRNA處理后，也觀察到類似效果。因此，siRNA干擾技術(shù)可能是解決臨床上藥物抗性的主要手段之一。endprint

CDK及其相關(guān)蛋白表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。不少外源性或者是內(nèi)源性的CDK抑制劑在抑制CDK后，都能很好的抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而單獨(dú)CDK抑制劑治療，會(huì)有腫瘤逃逸的現(xiàn)象，而無(wú)法根治腫瘤。因此與其他治療手段聯(lián)合的治療方式，將是CDK抑制劑研究的方向之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Yao G，Lee TJ，Mori S，et al.A bistable Rb-E2F switch underlies the restriction point[J].Nature Cell Biology，2008，10（4）：476-482.

[2] Garrett MD and Fattaey A.CDK inhibition and cancer therapy[J].Current Opinion in Genetics & Development， 1999，9（1）：104-111.

[3] Lapenna S， Giordano Antonio.Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer[J].Drug Discovery，2009，8（1）：547-566.

[4] Shapiro GI.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment[J].Journal of Clinical Oncology，2006，24（11）：1770-1783.

[5] Malumbres M，Barbacid M.Cell cycle，CDKs and cancer：a changing paradigm[J].Nat Rev Cancer，2009，9（3）：153-166.

[6] Malumbres M，Barbacid M.Mammalian cyclin-dependent kinases[J].Trends Biochem Sci，2005，30（11）：630-641.

[7] Vermeulen K，Bockstaele DRV，Berneman ZN.The cell cycle： a review of regulation， deregulation and therapeutic targets in cancer[J].Cell Prolif，2003，36（3）：131-149.

[8] Senderowicz AM.Targeting cell cycle and apoptosis for the treatment of human malignancies[J].Current Opinion in Cell Biology，2004，16（6）：670-678.

[9] Fleming IN，Hogben M，F(xiàn)rame S，et al.Synergistic inhibition of ErbB signaling by combined treatment with seliciclib and ErbB-targeting agents[J].Clin Cancer Res，2008，14（13）：4326-4335.

[10] Dent P，Curie DT，F(xiàn)isher PB，et al. Synergistic combinations of signaling pathway inhibitors：Mechanisms for improved cancer therapy[J].Drug Resist Updat，2009，12（3）：65-73.

[11] Jung YJ，Lee KH，Choi DW.Reciprocal expressions of cyclin E and cyclin D1 in hepatocellular carcinoma [J].Cancer Letters，2001，168（1）：57-63.

[12] Green SR，F(xiàn)rame S，Watt K，et al.Identification of pharmacodynamic biomarkers for CYC202 （R-roscovitine），a cyclin dependent kinase inhibitor[J].Proc Amer Assoc Cancer Res，2004，45（1）： 1442-1451.

[13] Keyomarsi K，O'Leary N，Molnar G，et al.Cyclin E，a potential prognostic marker for breast cancer [J].Cancer Research，1994，54（1）：380-385.

[14] Hwang HC，Clurman BE.Cyclin E in normal and neoplastic cell cycles[J].Oncogene，2005，24（1）：2776-2786.

[15] Freemantle SJ，Liu X，F(xiàn)eng Q.Cyclin Degradation for cancer therapy and chemoprevention[J].Journal of Cellular Biochemistry，2007，102（2）：869-877.

[16] Bettayeb K，Oumata N，Echalier A，et al.CR8，a potent and selective， roscovitine-derived inhibitor of cyclin-dependent kinases[J].Oncogene，2008，27（1）：5797-5807.endprint

[17] Misra RN.Clinical progress of selective cyclin-dependent kinase（CDK）inhibitors[J].Drugs of the Future，2006，31（1）：43-52.

[18] 翟德忠，黃強(qiáng).細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶cdc2與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究[J].腫瘤，2006，26（5）：489-491.

[19] Noble MEM，Endicott JA，Johnson LN.Protein kinase inhibitors：insights into drug design from structure[J].Drug discovery，2004，303（5665）：1800-1805.

[20] Hsieh WS，Soo R，Peh BK，et al.Pharmacodynamic effects of seliciclib，an orally administered cell cycle modulator，in undifferentiated nasopharyngeal cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15（4）：1435-1442.

[21] Mcclue SJ，Blake D，Clarke R，et al.In Vitro and in Vivo antitumor properties of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 （R-Roscovitine）[J].International Journal of Cancer，2002，102（5）：463-468.

[22] Meijer L，Raymond E.Roscovitine and Other Purines as kinase inhibitors.From starfish oocytes to clinical trials[J].Accounts of Chemical Research，2003，36（6）：417-425.

[23] Aldoss IT，Tashi T，Ganti AK.Seliciclib in malignancies[J].Expert Opinion on Investigational Drugs， 2009，18（12）：1957-1965.

[24] Appleyard MVCL，Neill1 MAO，Murray KE，et al. Seliciclib （CYC202，R-roscovitine） enhances the antitumor effect of doxorubicin in vivo in a breast cancer xenograft model[J].International Journal of Cancer， 2009，124（2）：465-472.

[25] Lima RT，Martins LM，Guimaraes JE，et al.Specific downregulation of bcl-2 and xIAP by RNAi enhances the effects of chemotherapeutic agents in MCF-7 human breast cancer cells[J].Cancer Gene Therapy，2004，11（1）：309-316.

[26] Li K，Lin SY，Brunicardi FC，et al.Use of RNA Interference to Target Cyclin E-overexpressing Hepatocellular Carcinoma[J].Cancer Research，2003，63（1）：3593-3597.

[27] Galimberti F，Thompson SL，Liu X，et al.Targeting the Cyclin E-Cdk-2 complex represses lung cancer growth by triggering anaphase catastrophe[J].Clin Cancer Res，2010，16（1）：109-120.

[28] 曹銀芳，關(guān)澤紅，劉新風(fēng).靶向CDK2、cyclinE的siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞周期及凋亡的影響[J].內(nèi)蒙古 醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009，3l（3）：191-194.

[29] Wang R，Lin F，Wang X，et al.Silencing Livin gene expression to inhibit proliferation and enhance chemosensitivity in tumor cells[J].Cancer Gene Therapy，2008，15（1）：402-412.

[30] Chistiane Nieth，Axel Priebsch，Alexandra Stege，et al.Modulation of the classical multidrug resistance （MDR）phenotype by RNA interference RNAi）[J].FEBS letters，2003，545（2-3）：144-150.

（收稿日期：2014-04-16）endprint