復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎齦溝液IL-4和TNF-α的影響

程鳳峽 田華 吳永生 王志潔 鄭瑤

·論著·

復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎齦溝液IL-4和TNF-α的影響

程鳳峽 田華 吳永生 王志潔 鄭瑤

目的研究復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙齦指數(shù)(GI)、牙周袋深度(PD)、附著喪失程度(AL)及齦溝液中白介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響。方法選用Wister大鼠42只，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(N組)，陽(yáng)性對(duì)照組(C組)和實(shí)驗(yàn)組(T組)，每組14只。C組和T組建立牙周炎模型后，C組給米諾環(huán)素軟膏治療，T組給復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠治療，均為每周上藥1次共4次，并分別在治療前和治療后記錄GI、PD、AL及齦溝液中IL-4和TNF-α水平。結(jié)果治療后，C組和T組GI、PD、AL均較治療前顯著下降(P<0.05)。牙周炎大鼠齦溝液中IL-4水平顯著低于正常組(P<0.05)，治療后顯著增高(P<0.05)，且T組明顯高于C組(P<0.05)；牙周炎大鼠齦溝液中TNF-α水平顯著高于正常組(P<0.05)，治療后顯著降低(P<0.05)，T組和C組治療后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠能明顯改善牙周炎臨床癥狀，顯著降低齦溝液中TNF-α水平，提高齦溝液中IL-4水平。

緩釋凝膠；多西環(huán)素；骨碎補(bǔ)；齦溝液；白介素-4；腫瘤壞死因子-α

牙周炎是菌斑微生物引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，是成年人失牙的主要原因。牙周致病菌及其毒性產(chǎn)物引發(fā)的宿主免疫和炎性反應(yīng)是造成牙周組織破壞的主要原因[1]。對(duì)于調(diào)節(jié)宿主防御功能的治療方法研究者們有許多嘗試，但多集中于西藥或中藥的全身應(yīng)用，這在很大程度上限制了研究結(jié)果的臨床應(yīng)用。復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠是我院自己研制的牙周炎局部緩釋制劑，主要有效成分是鹽酸多西環(huán)素和骨碎補(bǔ)。本實(shí)驗(yàn)將其應(yīng)用于大鼠的實(shí)驗(yàn)性牙周炎，比較治療前后臨床癥狀和齦溝液內(nèi)一些局部組織免疫產(chǎn)物的濃度，評(píng)估其對(duì)于宿主牙周炎牙周組織的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備 梅特勒AG-254電子分析天平，ALISEI全自動(dòng)酶標(biāo)儀，SANYO MDF-382低溫冰箱，Hettich RS-28型低溫離心機(jī)，多西環(huán)素(華北制藥集團(tuán))，1-甲基-2-吡咯烷酮(1MP)、三乙酸甘油酯(GAT) 由北京奇松生物科技有限公司提供，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)由長(zhǎng)春圣博瑪生物材料有限公司提供，派力奧軟膏(日本新時(shí)代制藥株式會(huì)社)。

1.2 復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠制備 骨碎補(bǔ)煎煮、過(guò)濾，濃縮、醇沉，配制成質(zhì)量濃度為每毫升含1 g生藥的骨碎補(bǔ)提取液。精密稱取骨碎補(bǔ)提取液20 mg，用約100 mg混合溶劑(1MP∶GAT=7∶3)溶解，再取PLGA75∶25計(jì)600 mg，用混合溶劑1 g溶解，待完全溶解后，倒入含有骨碎補(bǔ)的試管中，加入多西環(huán)素原料200 mg，最后加入混合溶劑至2 g，漩渦震蕩，分裝，4℃避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用純種Wister大鼠，雌雄各21只，體重(250±10)g。隨機(jī)分為3組，每組14只。正常對(duì)照組(N組)：不做任何處理；陽(yáng)性對(duì)照組(C組)：米諾環(huán)素軟膏(派力奧)治療組；實(shí)驗(yàn)組(T組)：復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠治療組。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉20 mg/kg麻醉，C組和T組大鼠用直徑為0.2 mm的正畸鋼絲結(jié)扎雙側(cè)上頜第一磨牙，結(jié)扎絲盡量放入齦溝內(nèi)。自結(jié)扎日起動(dòng)物給予高糖喂養(yǎng)，8周后每組隨機(jī)取1只大鼠，麻醉下觀察第一磨牙牙周組織變化，探診牙周袋，處死動(dòng)物后制作右上頜第一磨牙牙體牙周聯(lián)合切片。成模標(biāo)準(zhǔn)為組織學(xué)觀察：結(jié)合上皮向根方增殖，固有層結(jié)締組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周膜纖維排列紊亂，牙槽骨吸收，可見(jiàn)骨陷窩。牙周炎模型鑒定成功后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉20 mg/kg麻醉，C組牙周袋內(nèi)注入鹽酸米諾環(huán)素軟膏(派麗奧軟膏，新時(shí)代株式會(huì)社)，T組給牙周袋內(nèi)注射復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠，均至齦緣有藥物溢出；每周1次，重復(fù)4次。在第1次上藥前(治療前)和最后1次上藥后1周(治療后)，記錄3組指標(biāo)。所有臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)均由同一位不了解分組情況的牙周醫(yī)生測(cè)定。

1.5 齦溝液IL-4和TNF-α含量測(cè)定 大鼠麻醉后雙側(cè)上頜第一磨牙牙面擦干隔濕，用3個(gè)已稱量的whatman濾紙條(2 mm×10 mm)插入取樣牙的頰側(cè)近中、中央及遠(yuǎn)中3個(gè)位點(diǎn)的牙周袋內(nèi)，直至遇輕微阻力為止，30 s后取出合并放入一個(gè)Ep管中(若有血液和唾液污染，則棄置不用)。用電子分析天平分別稱量齦溝液提取前濾紙條和Ep管的重量及其提取齦溝液后的重量，兩者相減即得齦溝液的重量，按1 mg/ml換算成體積。Ep管中加入PBS緩沖液200 μl，-70℃保存。檢驗(yàn)時(shí)室溫解凍，4℃離心10 min(1 000 r/min)，取上清液備用。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，按試劑盒說(shuō)明書(試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司)提供的操作方法，測(cè)定齦溝液內(nèi)IL-4和TNF-α含量。

1.6 牙周臨床指標(biāo)的測(cè)定

1.6.1 牙齦指數(shù)(GI)[1]：將牙周探針沿齦緣輕輕滑動(dòng)，觀察有無(wú)出血。0=正常牙齦；1=輕度炎癥: 輕度顏色改變，輕度水腫；2=中度炎癥：色紅，水腫，探診出血；3=重度炎癥：明顯發(fā)紅，水腫，紅腫明顯或有潰瘍，有自發(fā)出血傾向。

1.6.2 牙周袋深度(PD)：用牙周探針(Nordent SST,USA)測(cè)量近中頰、頰側(cè)、遠(yuǎn)中頰3個(gè)點(diǎn)牙周袋深度，取均值。

1.6.3 附著喪失程度(AL)：測(cè)量牙周袋深度后，當(dāng)探針尖沿牙根面退出時(shí)，探尋釉牙骨質(zhì)界位置，測(cè)得釉牙骨質(zhì)界到齦緣的距離，將袋深度減去該距離即為附著喪失的程度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療前C組和T組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與N組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，C組和T組GI、PD、AL和TNF-α均較治療前顯著下降(P<0.05)，IL-4有顯著上升(P<0.05)。治療后T組和C組比較，GI和TNF-α差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而PD、AL和IL-4的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，T組的改善更為明顯(P<0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 3組治療前后牙齦指數(shù)、牙周袋深度和附著喪失變化

表2 3組齦溝液中IL-4和TNF-α水平

注：與N組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05；與治療前比較，△P<0.05

3 討論

牙周袋內(nèi)緩釋藥物逐漸成為牙周病藥物治療的發(fā)展趨勢(shì)。牙周局部緩釋用藥的理想標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)對(duì)牙周致病菌有較強(qiáng)的殺滅或抑制作用；(2)藥物可持續(xù)釋放較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮作用，減少不良反應(yīng)；(3)可促進(jìn)牙周組織再生；(4)減少上藥頻率，提高患者依從性；(5)藥物可貼附在牙周袋中不易脫落，無(wú)不適；(6)緩釋載體有良好的生物相容性，無(wú)刺激，可生物降解；(7)劑型便于臨床操作，能深入牙周袋底及根分叉處等；但目前臨床尚沒(méi)有一種制劑能滿足這些要求[2，3]。

本研究緩釋凝膠中治療藥物多西環(huán)素和骨碎補(bǔ)提取液在牙周治療中具有抑菌、抗膠原酶、促進(jìn)成纖維細(xì)胞的成骨分化及在牙面附著等多重作用；PLGA作為緩釋輔料使藥物進(jìn)入牙周袋變成膜狀，不但能明顯延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間，還可以阻擋牙齦上皮向牙周袋內(nèi)生長(zhǎng)，且具有良好的生物相容性，可降解，已被FDA正式批準(zhǔn)為藥用輔料[4]；1-甲基-2-吡咯烷酮作為溶劑，三乙酸甘油酯作為增塑劑，均有良好的生物降解性能，對(duì)凝膠最終的物理性狀起到重要作用，滿足了牙周局部凝膠應(yīng)用方便，可深入牙周袋底部及根分叉區(qū)，藥物緩慢釋放，不易脫落，異物感小等要求。

牙周炎的發(fā)病過(guò)程與Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡的失調(diào)有密切關(guān)系，Th1型細(xì)胞因子可加重牙周組織的炎癥和增加牙槽骨的破壞程度，Th2型細(xì)胞因子可有效減輕牙周組織的病變程度，對(duì)牙周組織具有保護(hù)作用[5]。齦溝液是來(lái)源于牙周結(jié)締組織的滲出液，牙周組織對(duì)局部刺激的免疫反應(yīng)、炎癥情況以及牙周組織修復(fù)情況都可能會(huì)改變齦溝液的量及成分。

TNF-α是一種單核細(xì)胞來(lái)源的Thl型炎性因子，在牙周炎損害起重要作用，包括刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶，導(dǎo)致結(jié)締組織的破壞和骨吸收，刺激基質(zhì)細(xì)胞的凋亡從而限制牙周組織的修復(fù)，抑制成骨，提高中性粒細(xì)胞的吞噬功能促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒和分泌過(guò)氧化物酶，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子如IL-1、IL-6和IL-8等的產(chǎn)生從而啟動(dòng)炎性反應(yīng)[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎和牙齦炎患者齦溝液中的TNF-α水平高于健康者，慢性牙周炎患者齦溝液中TNFα水平與牙槽骨吸收活性呈正相關(guān)，通過(guò)治療，齦溝液中的TNFα水平明顯降低[8，9]。

IL-4是主要由活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在促進(jìn)以Th2細(xì)胞為特征的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-4被認(rèn)為可以通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞功能的作用及誘使單核細(xì)胞凋亡，抑制促炎因子IL-6、IL-1、TNF-α和PGE2，促進(jìn)IL-l受體拮抗劑(IL-lra)的產(chǎn)生；有研究認(rèn)為牙周炎組織中IL-4缺乏，在嚴(yán)重的牙周炎位點(diǎn)齦溝液中不能檢測(cè)到IL-4，基礎(chǔ)治療癥狀緩解后，在相同位點(diǎn)的GCF中可檢測(cè)到IL-4的存在[10，11]；而也有學(xué)者報(bào)道基礎(chǔ)治療控制炎癥后，IL-4水平雖有升高但與治療前無(wú)顯著差異，認(rèn)為這可能是因?yàn)樗拗鞅旧鞩L-4缺乏導(dǎo)致了易感人群的牙齦炎發(fā)展成了牙周炎[12，13]。

根據(jù)中醫(yī)的理論，腎虛是牙周病發(fā)病的主要因素，腎主骨生髓，齒為骨之余，腎虛則齒衰，腎固則齒堅(jiān)。楊霞等用益氣滋腎合劑治療大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎發(fā)現(xiàn)治療后牙齒的松動(dòng)度有明顯改善，外周血中TNF-α和IL-1β水平顯著降低，牙槽骨的密度有一定程度的增加[14]。補(bǔ)腎合劑可以降低實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠外周血中TNF-α的表達(dá)水平，改善牙周菌群和牙周狀況[15，16]。許彥枝等[17]在牙周袋內(nèi)應(yīng)用雙黃補(bǔ)緩釋藥條(主要成分為黃連、黃芩、骨碎補(bǔ))治療慢性牙周炎發(fā)現(xiàn)治療后牙周指標(biāo)明顯改善，齦溝液中的LDH、ALP和AST水平均有明顯下降。謝雁鳴等[18]研究證實(shí)骨碎補(bǔ)能抑制IL-6、TNF-α釋放和促進(jìn)IL-4分泌的作用。

多西環(huán)素不僅對(duì)多種牙周可疑致病菌有很強(qiáng)的抑菌作用，還能通過(guò)多種途徑發(fā)揮宿主免疫調(diào)節(jié)作用。多西環(huán)素通過(guò)與膠原酶活化所必需的金屬離子螯合，抑制膠原酶的產(chǎn)生和分泌，減輕局部組織破壞。Golub等[19]還報(bào)道了多西環(huán)素可以直接抑制牙周炎組織中中性粒細(xì)胞來(lái)源的基質(zhì)金屬蛋白酶活性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎齦溝液中IL-4顯著低于正常組，TNF-α顯著高于正常。復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠治療4周后，GI、PD和AL等臨床指標(biāo)得到明顯改善，且實(shí)驗(yàn)組PD和AL的改善較米諾環(huán)素膏組更為明顯。T組治療后齦溝液內(nèi)TNF-α水平顯著降低，IL-4水平顯著增高，且較米諾環(huán)素膏組增高顯著。這些結(jié)果表明復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠通過(guò)多西環(huán)素和骨碎補(bǔ)的多種作用途徑減輕了牙周局部炎癥、結(jié)締組織附著的喪失及牙槽骨吸收，這可能尚不能說(shuō)明復(fù)方多西環(huán)素緩釋凝膠的應(yīng)用調(diào)節(jié)了局部牙周組織的Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡，但其對(duì)宿主局部防御調(diào)節(jié)的影響及機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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Effect of compound doxycycline sustained-release gel on IL-4 and TNF-αlevels in gingival crevicular fluid in rats with experimental periodontitis

CHENGFengxia,TIANHuan,WUYongsheng,etal.DepartmentofStomatology,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo observe the effect of compound doxycycline sustained-release gel on gingival index (GI),depth of pocket (PD),attachment loss (AL),IL-4 and TNF-α levels in gingival crevicular fluid (GCF) of rats with experimental periodontitis.MethodsForty-two Wistar rats were randomly divided into 3 groups: normal control group (group N),positive control group (group C) and trial group (group T),with 14 rats in each group.After periodontitis models were established,the rats in group C were treated by minocycline ointment,however,the rats in group T were treated by compound doxycycline sustained release gel.The rats in both groups accepted treatment once a week for 4 weeks.The GI,PD,AL,IL-4 and TNF-α levels were detected and recorded before and after treatment.ResultsAfter treatment,GI,PD,AL in group C and group T were significantly decreased (P<0.05).IL-4 levels in GCF of rats with periodontitis were significantly lower than those in group N (P<0.05),however,IL-4 levels were significantly increased after treatment (P<0.05).After treatment,IL-4 levels in group T were obviously higher than those in group C (P<0.05).TNF-α levels in GCF of rats with periodontitis were significantly higher than those of group N,however,TNF-α levels were significantly decreased after treatment (P<0.05).There were no significant differences in TNF-α levels between group T and group C after treatment (P>0.05).ConclusionCompound doxycycline sustained-release gel can obviously improve clinical symptoms of periodontitis,which can obviously decrease TNF-α levels and increase IL-4 levels in GCF.

sustained-release gel; doxycycline; rhizoma drynariae; GCF; IL-4; TNF-α

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.06.002

050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院口腔科

R 780.2

A

1002-7386(2014)06-0809-04

2013-07-11)