寶藿苷Ⅰ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制*

孫欣光 ，黃文華 ，郭寶林 ，丁曉靜 ，賀圓 ，劉軍

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013； 3.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，北京 100013）

寶藿苷Ⅰ （淫羊藿次苷II，BaohuosideⅠ）為小檗科淫羊藿屬（Epimedium L）多種植物中的一種黃酮類(lèi)化合物。藥理研究表明寶藿苷Ⅰ 具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等作用［1–2］。《中國(guó)藥典》（2010 年版）規(guī)定寶藿苷Ⅰ為淫羊藿飲片的質(zhì)量控制成分。

筆者根據(jù) JJF 1006–1994 等技術(shù)文件［3–4］研制了寶藿苷Ⅰ化學(xué)純度有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可應(yīng)用于相關(guān)化學(xué)藥品、中藥產(chǎn)品、保健品的質(zhì)量控制，為實(shí)現(xiàn)我國(guó)準(zhǔn)確定量檢測(cè)藥品與相關(guān)物質(zhì)提供了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

寶藿苷Ι分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 寶藿苷Ι的分子結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–質(zhì)譜儀：Agilent 1100型，液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）和3200Qtrap型三重四極桿–離子阱復(fù)合型質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）；

核磁共振儀：AV–600型，德國(guó)Bruker公司；

高效液相色譜（HPLC）儀：2690型泵模塊，996型DAD紫外檢測(cè)器，Empower化學(xué)工作站，美國(guó)Waters公司；

毛細(xì)管電泳儀：P/ACE 5000型，具紫外檢測(cè)器，配ACE Station工作站，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；

卡爾費(fèi)林水分測(cè)定儀：DL39型，瑞士Merrler Toledo 公司；

熱重分析儀（TGA）：Pyris 1 TGA型，美國(guó)PE公司；

乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher Scientific 公司；

卡爾費(fèi)休試劑：HYDRANAL?–Coulomat AG –H 型，德國(guó) Riedel–deHaen 公司；

超純水：美國(guó)Milli-Q超純水機(jī)制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和純化

研制的寶藿苷Ⅰ由淫羊藿提取物分離純化獲得，淫羊藿提取物購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司。

將淫羊藿提取物通過(guò)正相硅膠柱色譜、凝膠柱色譜等分離純化手段獲得純度流分，用HPLC法檢測(cè)寶藿苷Ⅰ的純度，合并純度大于99.6%的流分，重結(jié)晶，常溫干燥，對(duì)寶藿苷Ⅰ進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，用HPLC法對(duì)寶藿苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性初驗(yàn)，分裝到潔凈的的棕色玻璃瓶中。共分裝230瓶，每瓶約20 mg，常溫、密封儲(chǔ)存在干燥處。

1.3 定性分析

用液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法和核磁共振技術(shù)對(duì)寶藿苷Ⅰ進(jìn)行定性確認(rèn)。

1.4 純度定值分析

寶藿苷Ⅰ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用HPLC法和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC）法進(jìn)行定值。

1.4.1 樣品溶液的制備

精密稱(chēng)取寶藿苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)2 mg于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至標(biāo)線(xiàn)，配制成200 μg/mL寶藿苷的甲醇溶液備用。

1.4.2 HPLC儀工作條件

色 譜 柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）–水（B），流速為1.0 mL/min；梯度淋洗程序：0～15 min，20%～28% B；15～20 min，28%～35% B ；20～40 min，35%～39% B ；40～60 min，39%～90% B ；60～62 min，30%～100% B ；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260，265，270，275 nm ；定值波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣質(zhì)量濃度：1 mg/mL。

1.4.3 MECC儀工作條件

毛細(xì)管：涂層熔融石英毛細(xì)管（47 cm×50 mm，河北鑫諾光纖色譜有限公司）；分離緩沖液：10 mmol/L Na2B4O7–10 mmol/L H3BO3–60 mmol/L十二烷基硫酸鈉（SDS）混合溶液；樣品介質(zhì)：10 mmol/L Na2B4O7–10 mmol/L H3BO3–60 mmol/L SDS溶液；分離電壓：13 kV；進(jìn)樣質(zhì)量濃度：0.2 mg/mL；進(jìn)樣時(shí)間：3 s；進(jìn)樣壓力：3 447.5 Pa；分離溫度：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm。

1.5 雜質(zhì)分析

寶藿苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的雜質(zhì)分析主要包括水分（含揮發(fā)性成分）和無(wú)機(jī)元素分析。

寶藿苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的水分用TGA法測(cè)定：取樣品8 mg，初始溫度35℃，穩(wěn)定1 min后，以10℃/min升溫至105℃（目的是使樣品恒重），保持溫度1 h，測(cè)定損失的質(zhì)量。

采用ICP–MS法分析測(cè)定樣品中73種無(wú)機(jī)元素的含量。若各部分雜質(zhì)含量小于0.01%，則可忽略不計(jì)。

1.6 樣品均勻性和穩(wěn)定性考察

根據(jù)《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》［3］的要求對(duì)寶藿苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。具體抽樣檢驗(yàn)方法：隨機(jī)抽取15 瓶，進(jìn)行瓶間均勻性檢驗(yàn)；在任意一瓶取7 個(gè)子樣，進(jìn)行瓶?jī)?nèi)均勻性檢驗(yàn)。檢驗(yàn)方法為定值方法的HPLC 法，測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性考察按先密后疏的原則，在一定時(shí)間間隔內(nèi)選擇定值方法即HPLC法，檢測(cè)在規(guī)定條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度隨時(shí)間的變化情況，通常情況下，分別在第 1，3，6，12個(gè)月進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)。每次取5 瓶，每瓶取一個(gè)子樣，測(cè)定3次，計(jì)算平均值，把5 瓶測(cè)量結(jié)果平均值作為檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果的變動(dòng)在定值結(jié)果不確定度范圍內(nèi)作為判定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定的原則。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

2.1.1 質(zhì)譜分析

寶藿苷Ι標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 寶藿苷Ι的質(zhì)譜圖

由圖2可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰［M+H］m/z514.92和［M+Na］m/z537.08，與寶藿苷Ι相對(duì)分子質(zhì)量（513）相吻合。另外還可以得到脫去鼠李糖的離子碎片（m/z369.17）。

2.1.2 核磁共振譜分析

表1和表2分別為寶藿苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的1H–NMR和13C–NMR測(cè)定數(shù)據(jù)，表中數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，表明此樣品是寶藿苷Ι。

表1 寶藿苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的1H–NMR數(shù)據(jù)（DMSO）

2.2 純度定值

從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取9 瓶，按1.4.1項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并分別按1.4.2項(xiàng)和1.4.3項(xiàng)的方法檢測(cè)純度，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為定值方法不確定度的一部分。兩種定值方法的平均值作為定值結(jié)果。

2.2.1 HPLC法

制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液采用HPLC法定值時(shí)，分別在波長(zhǎng)為 260，265，270，275 nm 處進(jìn)行檢測(cè)，在波長(zhǎng)270 nm處寶藿苷Ι有最大響應(yīng)值，因此定值波長(zhǎng)選為270 nm。圖3 為寶藿苷Ⅰ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于270 nm下的HPLC定值譜圖。

表2 寶藿苷Ι標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的13C–NMR數(shù)據(jù)（DMSO）

圖3 寶藿苷Ⅰ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的HPLC譜圖

從圖3可以看出，寶藿苷Ⅰ與雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)了很好的分離，說(shuō)明HPLC可以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定值。

2.2.2 MECC法

制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液采用MECC法定值時(shí)，為了使更多的雜質(zhì)峰能夠被檢測(cè)到，選擇200 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。圖4為寶藿苷Ⅰ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的MECC譜圖，從圖4可見(jiàn)，寶藿苷Ⅰ與雜質(zhì)達(dá)到基線(xiàn)分離，可以對(duì)其純度準(zhǔn)確定量。

圖4 寶藿苷Ⅰ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的MECC譜圖

兩種方法定值結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出HPLC法和MECC法兩種定值結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.01%，0.08%，說(shuō)明定值方法的重復(fù)性很好，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的技術(shù)要求。

表3 寶藿苷Ι純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度測(cè)定結(jié)果 %

2.3 雜質(zhì)分析

寶藿苷Ⅰ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品水分的測(cè)定結(jié)果為0.11%。

無(wú)機(jī)元素 Li，Be，B，Na，Mg，Al，Si，S，Cl，K，Ca，Sc，Ti，V，Cr，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu ，Zn，Ga，Ge，As，Se，Br，Kr，Rb，Sr，Y，Zr，Nb，Mo，Ru，Rh，Pd，Ag，Cd，In，Sn，Sb，Te，I，Cs，Ba，La，Ce，Pr，Nd，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu，Hf，Ta，W，Re，Os，Ir，Pt，Au，Hg，Tl，Pb，Bi，Th 和 U的含量之和小于0.01%，可忽略不計(jì)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和穩(wěn)定性考察

寶藿苷Ι標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性考察結(jié)果分別見(jiàn)表4、表5。

表4 寶藿苷Ι純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果 %

表5 寶藿苷Ι純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)F檢驗(yàn)法和t檢驗(yàn)法對(duì)寶藿苷Ι純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性進(jìn)行考察，得F=3.73，查表知F0.05(14，6)=3.96，則F＜F0.05(14，6)，t=0，tα=0.003，t≤tα，表明瓶間和瓶?jī)?nèi)均勻性一致。在穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)定值結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)顯著的逐漸增大或減少的趁勢(shì)，證明寶藿苷Ι純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是穩(wěn)定的。

2.5 定值不確定度評(píng)定

純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過(guò)程引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性引入的不確定度。

2.5.1 HPLC法定值不確定度

（1）HPLC法定值測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u1，由測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，u1=0.01%。

（2）各組分不同檢測(cè)波長(zhǎng)的響應(yīng)值引入的不確定度u2，綜合考慮主成分和雜質(zhì)化合物在相應(yīng)檢測(cè)波長(zhǎng)處的響應(yīng)，計(jì)算得u2=0.1%。

合成得HPLC法的測(cè)量不確定度：

2.5.2 MECC法定值不確定度

MECC法定值測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度uCE，由測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，uCE=0.08%。

2.5.3 定值不確定度u

定值不確定度u由u與u不確定度合成：

2.5.4 定值結(jié)果的總合成不確定度

寶霍苷I標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的瓶間均勻性不確定度uH1、瓶?jī)?nèi)均勻性不確定度uH2、穩(wěn)定性不確定度uT分別用其測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示，則合成不確定度uc由下式計(jì)算：

2.5.5 擴(kuò)展不確定度

U＝kuc＝0.13%×2=0.26%≈0.3%。

2.6 定值結(jié)果

寶藿苷Ι標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值采用質(zhì)量平衡法，即采用HPLC 和MECC 兩種定值技術(shù)測(cè)量值的平均值扣除水分等無(wú)機(jī)雜質(zhì)之后的結(jié)果。

寶藿苷Ι標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值：

P=(1–0.11%)×[(99.85%+99.72%)/2]=99.7%

定值結(jié)果為(99.7±0.3)%，k=2。

3 結(jié)語(yǔ)

寶霍苷I純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料經(jīng)過(guò)質(zhì)譜、核磁定性分析后，分別進(jìn)行了水分、無(wú)機(jī)元素含量分析。采用兩種不同原理的方法對(duì)寶霍苷I標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，避免了由單一方法定值測(cè)量的系統(tǒng)誤差。對(duì)寶霍苷I標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行雜質(zhì)分析、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察、不確定度評(píng)定，所使用的量值及不確定度都是準(zhǔn)確可靠的?；瘜W(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制將對(duì)我國(guó)藥品的質(zhì)量有效控制起到積極的促進(jìn)作用［5–8］。

［1］Huang C，Chen X，Guo B，et al. Induction of Apoptosis by Icariside II through Extrinsic and Intrinsic Signaling Pathways inHuman Breast Cancer MCF7 cells［J］. Bioscience, Biochnology，and Biochemistry，2012，76: 1 322–1 328.

［2］Huang J，Yu an L，Wang X，et al. Icaritin and its glycosides enhance osteoblastic，but suppress osteoclastic，differentiation and activity in vitro ［J］. Life Sci，2007，81(10): 832–840.

［3］JJG 1006–1994 一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范［S］.

［4］郭寶林，余競(jìng)光，肖培根.淫羊藿化學(xué)成分的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，1996，21(5): 290–292.

［5］全浩，韓永志，賴(lài)喜平，等.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其應(yīng)用技術(shù)［M］.2版.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［6］楊淑麗，趙志鴻，張玉龍.淺談?dòng)袡C(jī)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和定值［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2000，9(1): 37–39.

［7］韓永志 .標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2001，10(5):38–39.

［8］韓永志，寒冰.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的溯源性及不確定度［J］.化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量質(zhì)量，2002，10(1): 21–24.