EBV-DNA拷貝數(shù)和EBERs原位表達(dá)在鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤診斷中的一致性研究

鄧玲 邵建永 張旭 湯濤 邵瓊 李銀珍

NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)于2001年WHO正式納入惡性淋巴瘤的病理新分型，屬于結(jié)外非霍奇金淋巴瘤中一種獨立的臨床病理疾病，主要分為鼻NKTCL和結(jié)外鼻型NKTCL[1]。鼻NKTCL因絕大部分好發(fā)于鼻腔而得名。此型淋巴瘤具有獨特的免疫表型、特殊的組織形態(tài)以及生物學(xué)行為，其發(fā)病具有地域特色，亞洲地區(qū)為高發(fā)區(qū)，大部分集中在中國南部，罕見于歐美國家。其臨床進(jìn)展快，具有高度侵襲性，臨床預(yù)后差。在臨床病理診斷中，由于組織中有大量的炎癥細(xì)胞浸潤、大片壞死以及不典型增生常常導(dǎo)致誤診和(或)診斷延遲[2]。為提高鼻NKTCL的診斷率，本研究針對我院診斷的50例鼻腔NKTCL的臨床資料回顧性分析，并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測相關(guān)抗原的表達(dá)，實時定量PCR檢測EBV-DNA 拷貝數(shù)以及原位雜交技術(shù)檢測EBV編碼的RNA。綜合組織形態(tài)學(xué)，分子標(biāo)記物表達(dá)情況，提高我們對本病的認(rèn)識。

材料與方法

一、材 料

收集我院2010年1月至2011年10月診治的鼻NKTCL 50例。其中男40例，女10例，年齡12～72歲，中位年齡49歲。所有標(biāo)本均用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測CD3, CD45RO, CD20, CD56, CD79a，TIA1，Granzyme B確定腫瘤細(xì)胞的免疫表型(由病理科技術(shù)員完成)。根據(jù)2001年WHO關(guān)于淋巴造血組織腫瘤分類鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)組織形態(tài)學(xué)、臨床特征以及上述提及的免疫組織化學(xué)結(jié)果，由經(jīng)驗豐富的2位病理醫(yī)生共同診斷為鼻NKTCL。

二、免疫組織化學(xué)

常規(guī)石蠟切片，4～5 μm。切片脫蠟至水。pH 8.0的EDTA 高壓抗原修復(fù)后至室溫冷卻。3%過氧化氫封閉10 min以降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色。依次滴加不同的抗體，包括CD3, CD45RO, CD20, CD56, CD79a，TIA1，Granzyme B，放置于37℃溫箱40 min。PBS 緩沖液洗2 min，共3次。滴加DAKO二抗，溫箱30 min。DAB 顯色，于顯微鏡下觀察。

三、實時定量PCR檢測EBV-DNA拷貝數(shù)

①基因組DNA提?。菏灅?biāo)本5 μm切片10張置于干燥離心管，應(yīng)用QIAGEN公司石蠟組織基因DNA提取純化試劑盒從石蠟組織中提取基因組DNA(具體操作步驟見試劑盒說明書)，將提取的基因組DNA進(jìn)行EBV-DNA檢測。EBV上游引物：AATTTTTTCTGCTAAGCCCAACA；下游引物：ACGGGTGGGTGTGTGTAGTGT；探針: FCCACCACACCCAGGCP。②實時熒光定量PCR檢測：熒光定量PCR原理，參考文獻(xiàn)[3]。采用Taqman技術(shù)，利用實時熒光定量PCR方法對EBV-DNA濃度進(jìn)行檢測，總反應(yīng)體系為15 μl，其中包括模板DNA 2 μl，反應(yīng)混合液13 μl (含ABI Universal master MixⅡ、檢測引物及特異位點探針、H2O)，每次反應(yīng)均設(shè)置陽性及陰性對照。熒光定量PCR儀型號為ABI 7500。PCR反應(yīng)條件分別為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，共50個循環(huán)。③結(jié)果：PCR擴(kuò)增結(jié)果用自動分析軟件Sequence Detection System software (Version 2.0)進(jìn)行自動分析(美國ABI公司)。每批PCR反應(yīng)用雙蒸水作為陰性對照，克隆合成的EB病毒W(wǎng)片段作為陽性對照，并稀釋成不同的濃度梯度(107，106，105, 104,103, 102拷貝/μl)，其相關(guān)系數(shù)R2=0.99，繪制成定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

四、原位雜交檢測地高辛標(biāo)記EBV編碼的小RNA(EBERs)的表達(dá)

對NK/TCL石蠟組織進(jìn)行EBERs原位雜交，計算陽性細(xì)胞數(shù)占總腫瘤細(xì)胞的的百分比。原位雜交所用的試劑盒購買于北京中杉金橋公司。實驗步驟如下：組織切片脫蠟水化，胃蛋白酶于室溫下消化15 min，EBERs探針37℃雜交，雜交完成后，滴加鏈接有辣根過氧化物酶的抗地高辛抗體，37℃ 45 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。相關(guān)性分析用Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、鼻NKTCL患者臨床表現(xiàn)、病理形態(tài)學(xué)及EBERs原位雜交檢測

50例中幾乎所有患者發(fā)生鼻出血、壞死以及潰瘍100% (50/50)， 部分患者伴有消瘦、盜汗。由于廣泛的鼻部壞死，出現(xiàn)鼻、口腔分泌物惡臭，這是一個非常特異的臨床表現(xiàn)。鼻NKTCL多有凝固性壞死表現(xiàn)，因此病理形態(tài)學(xué)常表現(xiàn)為腫瘤性淋巴細(xì)胞彌漫或散在分布，腫瘤細(xì)胞大小不等，核深染，不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞核多呈泡狀，核仁不明顯或有小核仁，核分裂易見(圖1A)。腫瘤細(xì)胞浸潤破壞血管壁及病灶內(nèi)反應(yīng)性炎細(xì)胞浸潤。免疫組織化學(xué)標(biāo)記物CD3、CD56、TIA1、Granzyme B均為陽性(圖1B、C、D、E)。對50例鼻NKTCL患者的石蠟組織做原位雜交檢測EBERs表達(dá)(圖1F)，結(jié)果所有的病例均為陽性，陽性表達(dá)率達(dá)100%。鼻NKTCL EBERs原位雜交陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比(中位分值為53%)，與相應(yīng)患者的對應(yīng)的石蠟組織的EBV-DNA定量檢測水平有顯著性相關(guān)性(Spearman 檢驗：rs=0.609,P<0.01)。

二、鼻NKTCL患者組織EBV-DNA實時定量PCR檢測

熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立見圖2A、B。實時定量PCR檢測50例NKTCL患者的石蠟組織中EBV-DNA的水平(圖2C)，其檢出率為100%(50/50)。而且，所有患者的EBV-DNA拷貝數(shù)均處于一個較高的水平，最小拷貝數(shù)為127.105，最大拷貝數(shù)為1 450 000，其中位拷貝數(shù)是23 750。

圖1 鼻NKTCL病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及原位雜交檢測EBERs表達(dá)

圖2 熒光定量PCR曲線

討 論

NKTCL是組織形態(tài)學(xué)復(fù)雜，需經(jīng)典型臨床表現(xiàn)、免疫組織化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)證實的惡性淋巴瘤[4]。主要發(fā)生在鼻部淋巴結(jié)外。其瘤細(xì)胞大部分來源于外周NK細(xì)胞，少部分來自NK/T細(xì)胞。

NKTCL的診斷主要是依據(jù)組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)。此型淋巴瘤具有非常特異的組織學(xué)表達(dá)。如大片樣壞死，侵犯血管，形成洋蔥樣結(jié)構(gòu)。本研究中的50例組織形態(tài)學(xué)典型，大量壞死、出血以及潰瘍的改變。其形態(tài)學(xué)的改變符合NKTCL組織學(xué)特征。免疫組織化學(xué)標(biāo)記物CD3、CD56、TIA1、Granzyme B陽性是NKTCL的診斷依據(jù)[5]。納入本次研究的50例鼻NKTCL患者的上述標(biāo)記物均為陽性。

大多數(shù)患者表現(xiàn)為EBV陽性表達(dá)，在我國患病人群中特別南方地區(qū)的EBV感染率是非常高的。免疫功能缺陷或紊亂，長期抗原刺激導(dǎo)致淋巴細(xì)胞異常增殖是本病的發(fā)病因素。這些研究結(jié)果均提示EBV是致病因子或者說是起到了病原學(xué)的作用[6]。有研究表明，高達(dá)75%～100%的瘤細(xì)胞表達(dá)EBV相關(guān)基因。本研究檢測的鼻NKTCL患者中的EBV-DNA 陽性率達(dá)到100%(50/50)。EBV-DNA對診斷NKTCL具有非常重要的參考價值。

目前，EBV編碼的EBERs已經(jīng)作為一種分子標(biāo)記物用于檢測組織中的EBV[7]。本研究分別采用實時定量PCR檢測EBV-DNA和原位雜交技術(shù)檢測EBERs。NKTCL均是陽性的，而且EBV-DNA水平和EBERs的表達(dá)水平有顯著性正相關(guān)，這就提示NKTCL中有EBV的整合。表明EBV相關(guān)抗原與基因與鼻NKTCL密切相關(guān)[8]。

綜上所述，石蠟組織中的EBV-DNA拷貝數(shù)和EBERs 的原位表達(dá)具有高度一致性。為臨床實驗工作者提供兩種不同的實驗方法，可根據(jù)自己所在的實驗室條件酌情選擇。

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