IMP1對人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

陳少英 黃振強(qiáng) 顧巍

乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界每年有115萬例新發(fā)患者[1]。近年我國乳腺癌的發(fā)病率呈上升及年輕化的趨勢。由于惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與癌細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)，故目前對于乳腺腫瘤的研究越來越多著眼于腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)與腫瘤的惡性發(fā)展和轉(zhuǎn)移的影響。既往研究表明，胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白1 (IMP1)可調(diào)控多種與細(xì)胞黏連和遷移相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而提高細(xì)胞的極性和定向移動能力[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在IMP1陰性的野生型乳腺癌細(xì)胞MDA231中轉(zhuǎn)入IMP1基因，能有效抑制MDA231細(xì)胞的遷移和侵襲[3]。對于IMP1對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，目前筆者尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本研究應(yīng)用經(jīng)綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的人乳腺癌MDA231-GFP細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)入與未轉(zhuǎn)入IMP1基因的MDA231-GFP 細(xì)胞株的體外生長情況，旨在探討IMP1對人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺癌細(xì)胞株MDA231-IMP1-GFP和MDA231-GFP均由美國愛因斯坦醫(yī)學(xué)院提供。

二、主要試劑和儀器

胎牛血清購于美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)染色液購于武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器包括CO2培養(yǎng)箱(美國Kendro公司)、倒置顯微鏡(日本Olympus公司)和酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

取對數(shù)生長期的MDA231-IMP1-GFP細(xì)胞和MDA231-GFP細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。顯微鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×105個(gè)/孔，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml。將6孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，用0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總數(shù)。

2.MTT檢測法

取對數(shù)生長期的MDA231-IMP1-GFP細(xì)胞和MDA231-GFP細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。顯微鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1.2×104個(gè)/孔，接種于48孔培養(yǎng)板中，每孔0.2 ml，以磷酸鹽緩沖液為空白對照組。將48孔培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別培養(yǎng)4、24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT液， 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。之后加入200 μl MTT溶解劑，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2～4 h。顯微鏡下觀察紫色結(jié)晶狀沉積物是否全部溶解，待沉積物溶解后，在波長570 nm處測定吸光度，吸光度越高，表明細(xì)胞增殖越快。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、MDA231-IMP1-GFP和MDA231-GFP 細(xì)胞的形態(tài)比較

普通光鏡下，MDA231-IMP1-GFP細(xì)胞與MDA231-GFP的細(xì)胞形態(tài)相似，見圖1A、C。熒光顯微鏡下，兩種細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光蛋白GFP，細(xì)胞均顯綠色，MDA231-IMP1-GFP細(xì)胞綠色熒光略為減淡，見圖1B、D。

圖1 MDA231-IMP1-GFP和MDA231-GFP細(xì)胞形態(tài)比較(×100)

二、不同時(shí)間點(diǎn)MDA231-IMP1-GFP和MDA231-GFP 細(xì)胞增殖情況比較

1.細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果

重復(fù)測量資料方差分析顯示，處理效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)之間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.139，P=0.004)，故采用簡單效應(yīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)28、48、72 h時(shí)MDA231-IMP1-GFP細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯少于MDA231- GFP細(xì)胞(P均<0.01)，兩組組內(nèi)的不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)均隨時(shí)間延長而增加(P均<0.05)，見表1。

2.MTT法檢測結(jié)果

重復(fù)測量資料方差分析顯示，處理效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)之間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.139，P=0.004)，故采用簡單效應(yīng)檢驗(yàn)，培養(yǎng)4 h時(shí)，兩組吸光度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在培養(yǎng)28、48、72 h時(shí)MDA231-IMP1-GFP細(xì)胞組的吸光度均比MDA231-GFP細(xì)胞組明顯減低(P均<0.05)，且隨著增殖時(shí)間的延長，其差異越明顯(P均<0.05)，見圖2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)MDA231-IMP1-GFP和MDA231-GFP 細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)MDA231-IMP1-GFP和MDA231-GFP 細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多基因相互作用的結(jié)果，其中細(xì)胞致癌基因的過度表達(dá)和抑癌基因的表達(dá)缺失起著至關(guān)重要的作用。基因療法作為一種新的癌癥治療模式，越來越受到人們的重視。乳腺癌是育齡婦女常見的惡性腫瘤，侵襲、轉(zhuǎn)移為目前研究熱點(diǎn)，其發(fā)生、發(fā)展作為潛在靶向治療節(jié)點(diǎn)日益受到重視。三陰型乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2均陰性表達(dá)的乳腺癌。雖然TNBC的發(fā)病率不及其他亞型乳腺癌,但因其臨床預(yù)后極差，且缺乏有效治療手段，故受到臨床的廣泛關(guān)注[4]。

IMP1是胰島素樣生長因子Ⅱ (IGFⅡ)mRNA結(jié)合蛋白之一，其與p62和Koc結(jié)構(gòu)類似[5-7]。IGFⅡ是腫瘤自分泌因子，在體內(nèi)、體外均有較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖能力。研究證實(shí)，IGFⅡ在多種腫瘤細(xì)胞中呈過度表達(dá)，而這除了與IGFⅡ基因異常表達(dá)有關(guān)外，也與其結(jié)合蛋白IMP的異常調(diào)控有關(guān)，IMP1與p62具有類似的結(jié)構(gòu)[8-9]。有報(bào)道，IMP1蛋白表達(dá)變化是食管癌、賁門癌和癌前病變組織的常見分子事件[10]。IMP1與乳腺癌的關(guān)系研究目前較少，為此，本研究采用目前檢測細(xì)胞增殖活力常用的細(xì)胞計(jì)數(shù)法及MTT法，觀察IMP1的表達(dá)對TNBC細(xì)胞株MDA231細(xì)胞增殖的影響[11-12]。研究結(jié)果顯示，攜帶IMP1基因的MDA231細(xì)胞增殖率明顯低于未攜帶IMP1基因的MDA231細(xì)胞(P<0.05)，且隨著增殖時(shí)間的延長，其抑制效果更加明顯。研究結(jié)果提示， IMP1具有抑制人乳腺癌MDA231細(xì)胞增殖的作用，這為乳腺癌的基因治療提供了理論依據(jù)，但有關(guān)IMP1的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究闡明。

[1] Kamangar F, Dores GM, Anderson WF. Patterns of cancer incidence, morality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world.J Clin Oncol,2006, 24: 2137-2150.

[2] Lapidus K, Wyckoff J, Mouneimne G, et al. ZBP1 enhances cell polarity and reduces chemotaxis. J Cell Sci，120：3173-3178.

[3] Gu W, Katz Z，Wu B, et al. Regulation of local expression of cell adhesion and motility-related mRNAs in breast cancer cells by IMP1/ZBP1.J Cell Sci, 125：81-91.

[4] 魏芳，劉浩，張配，等. EGCG對三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖抑制作用及機(jī)制. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29：680-684.

[5] Nielsen J, Christiansen J, Lykke-Andersen J, et al. A family of insulin-like growth factor II mRNA-binding proteins represses translation in late development. Mol Cell Biol, 1999, 19:1262-1270.

[6] Zhang JY,Chan EK, Peng XX, et al. A novel cytoplasmic protein with RNA-binding motifs is an autoantigen in human bepatocellular carcinoma. J Exp Med, 1999, 189:1101-1110.

[7] Muller-Pillasch F,Lacher U，Wallrapp C, et al. Cloning of a gene highly overexpressed in cancer coding for a novel KH-domain containing protein. Oncogene, 1997, 14:2729-2733.

[8] 趙芝鑫，陳希綱. IGFⅡ、VEGF和MVD在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義. 中國癌癥防治雜志，2011，3：46-52.

[9] 鄭艷莉，劉曼華，魯曉燕，等. IGFⅡ和HGF的表達(dá)與卵巢癌微血管密度的關(guān)系. 南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29：427-429.

[10] 杜芳，王立東，焦新英，等. 食管、賁門癌和癌前病變組織中IMP1蛋白的表達(dá)變化. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2006，22：425-428.

[11] Iop L, Renier V, Naso F, et al. The influence of heart valve leaflet matrix characteristics on the interaction between human mesenchymal stem cells and decellularized scaffolds. Biomaterials, 2009,30:4104-4116.

[12] Filová E, Straka F, Mirejovsky T, et al.Tissue-engineered heart valves. Physiol,2009, 58: S141- S158.