LRRK2活化Rho GTPases信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬α-突觸核蛋白中的作用機(jī)制

丁雪冰 王雪晶 馬明明 滕軍放

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)帕金森病及相關(guān)運(yùn)動(dòng)障礙疾病研究所 鄭州 450052 3)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

LRRK2活化Rho GTPases信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬α-突觸核蛋白中的作用機(jī)制

丁雪冰1，2)王雪晶1，2)馬明明3)滕軍放1，2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)帕金森病及相關(guān)運(yùn)動(dòng)障礙疾病研究所 鄭州 450052 3)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

目的 探討小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬α-突觸核蛋白的分子機(jī)制。方法 構(gòu)建α-Syn寡聚體誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化模型，免疫熒光檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)α-Syn陽性包涵體的數(shù)量。Western blot檢測(cè)BV-2細(xì)胞LRRK2蛋白的表達(dá)。Pull down檢測(cè)BV-2細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA的活性。結(jié)果 與對(duì)照組相比，α-Syn寡聚體誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞內(nèi)α-Syn陽性包涵體數(shù)量增加，LRRK2蛋白表達(dá)增加及Rac1、Cdc42、RhoA活性增加。結(jié)論 小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)α-突觸核蛋白的吞噬與LRRK2活化Rho GTPases信號(hào)通路相關(guān)。

LRRK2；Rho GTPases信號(hào)通路；小膠質(zhì)細(xì)胞；α-突觸核蛋白

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是人類最常見的神經(jīng)退行性疾病之一[1]。其病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元變性缺失及殘存神經(jīng)元胞漿中異常聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)陽性路易小體的形成[2]。隨著研究的不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在α-Syn陽性包涵體胞間播散過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞作為重要的傳遞媒介，在大量吞噬異常聚集的α-Syn后被持續(xù)激活,導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[3-4]。由此推測(cè)α-Syn陽性包涵體在小膠質(zhì)細(xì)胞間播散在PD進(jìn)展中起重要作用。

α-Syn寡聚體通過小膠質(zhì)細(xì)胞胞吞作用在相鄰細(xì)胞之間傳遞[5]，進(jìn)入受體細(xì)胞的α-Syn寡聚體，可以像“朊蛋白”一樣作為“種子”誘導(dǎo)正常構(gòu)象的α-Syn蛋白錯(cuò)誤折疊最終形成α-Syn陽性包涵體。通過這種模式α-Syn陽性包涵體在細(xì)胞間播散[6]，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷從黑質(zhì)向其他腦區(qū)擴(kuò)散。而抑制α-Syn寡聚體的胞間傳遞能夠阻斷LB的細(xì)胞間播散，從而減少神經(jīng)元的損傷。LRRK2基因(1eucine rich repeat kinase 2 gene，PARK8；OMIM 607060)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜等膜結(jié)構(gòu)，作為分子開關(guān)參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、骨架重塑及膜轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理過程[7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)LRRK2作為Rho GTPase的調(diào)控因子，介導(dǎo)上皮細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)。因此LRRK2很可能參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于α-Syn寡聚體的吞噬。本研究以小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬α-Syn寡聚體為切入點(diǎn)，檢測(cè)LRRK2活化Rho GTPases信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬α-突觸核蛋白中的作用機(jī)制，探索PD神經(jīng)元損傷的病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 BV-2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國GIBCO公司。LRRK2抗體購于美國Cell Signaling公司，α-Syn抗體購于美國 Santa Cruz Biotechnology公司，過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購于美國Promega公司，Alexa Fluor 633 標(biāo)記 Phalloidin購于美國Molecular Probes公司。Rac/Cdc42 Assay Reagent (PAK1 PBD，agarose)或 Rho Assay Reagent (Rhotekin RBD, agarose) 購于美國Millipore公司。人源重組α-Syn凍干粉購于Sigma公司。

1.2 α-Syn寡聚體誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化模型的構(gòu)建 BV-2細(xì)胞以1×106接種到12孔板中培養(yǎng)24 h后，換無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度0.5 μM的α-Syn寡聚體，對(duì)照組加入相應(yīng)體積PBS，并于37℃ 5% CO2中孵育24 h。

1.3 免疫熒光檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)α-Syn陽性包涵體 收獲細(xì)胞，PBS洗2次。加入-20℃預(yù)冷的丙酮于-20℃孵育10 min，再加入0.1% Triton，常溫孵育5 min，PBS洗3次。5% BSA 37℃孵育30 min。加入α-Syn抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，PBS洗3次。加入Alexa Fluor 488 標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶1000) 4℃孵育3 h，PBS洗3次。加入DAPI(1∶400)，常溫孵育3 min。于干凈的載玻片滴加封片劑，常溫下避光晾干過夜，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 Western blot檢測(cè)BV-2細(xì)胞蛋白表達(dá) 構(gòu)建α-Syn寡聚體誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化模型，提取細(xì)胞總蛋白，做SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBS洗3次，加入LRRK2及GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA抗體(1∶1000)，4℃過夜。加入過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5000)孵育2 h，PBS洗3次，ECL光化學(xué)法顯色。凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描。

1.5 Pull down檢測(cè)BV-2細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA活性 0.5 mL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液MLB裂解細(xì)胞10 min，離心收集上清。加入GST，冰上孵育10 min，離心收集上清。冰上取1 mL細(xì)胞提取液，加入20 μL Rac/Cdc42 Assay Reagent (PAK1 PBD, agarose)或 Rho Assay Reagent (Rhotekin RBD, agarose)冰上孵育2 h。離心去上清，500 μL Wash Buffer 洗滌沉淀，所得蛋白做Western blot檢測(cè)GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用AlphaEaseFC(FluorChem8900)軟件分析圖像結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)α-Syn陽性包涵體 構(gòu)建α-Syn誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化模型。免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，α-Syn誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞中α-Syn陽性包涵體數(shù)量增高。如圖1所示。

圖1 免疫熒光檢測(cè)BV-2細(xì)胞中α-Syn陽性包涵體(免疫熒光×400)

2.2 Western blot檢測(cè)BV-2細(xì)胞LRRK2蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，α-Syn誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞LRRK2蛋白表達(dá)增高。如圖2所示。

圖2 Western blot檢測(cè)BV-2細(xì)胞LRRK2蛋白表達(dá)

2.3 Pull down檢測(cè)BV-2細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA活性 構(gòu)建α-Syn誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化模型。Pull down結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，α-Syn誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞中GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA表達(dá)增高。表明Rac1、Cdc42、RhoA活性增高。如圖3所示。

圖3 Pull down檢測(cè)BV-2細(xì)胞Rac1、Cdc42、RhoA活性

3 討論

研究表明α-Syn陽性包涵體胞間播散介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，在PD進(jìn)展中起到重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要免疫炎癥反應(yīng)細(xì)胞，研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞與DA神經(jīng)元通過細(xì)胞間、細(xì)胞分子間的網(wǎng)絡(luò)式作用相互聯(lián)系參與了帕金森病的發(fā)生發(fā)展過程[8,9]。在α-Syn寡聚體的細(xì)胞間傳遞所介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化扮演了重要角色。作為免疫效應(yīng)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬功能。研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞能夠吞噬α-Syn寡聚體及單體，作為α-Syn寡聚體傳遞的重要載體，加速α-Syn陽性包涵體的細(xì)胞間播散，促進(jìn)PD的發(fā)展。研究表明，米諾環(huán)素、白細(xì)胞介素-10等抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物能夠減輕PD模型DA神經(jīng)元損傷。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的因子很可能通過促進(jìn)α-Syn寡聚體的內(nèi)吞而激活小膠質(zhì)細(xì)胞，介導(dǎo)DA神經(jīng)元的損傷，從而推動(dòng)PD的進(jìn)展。

LRRK2基因是新近在散發(fā)性、家族聚集性常染色體顯性遺傳的帕金森病患者中發(fā)現(xiàn)的致病基因。在細(xì)胞水平上LRRK2位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，參與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過程。LRRK2具有6個(gè)主要功能區(qū)域，其中ROC區(qū)域具有GTPases水解酶活性[10]，通過直接結(jié)合調(diào)控Rho GTPases的活性。研究表明，ROC區(qū)域與PD有關(guān)的突變(R1441C, R1441G)減弱了GTPase水解活性，增強(qiáng)了與GTP的結(jié)合，導(dǎo)致Rho GTPases的活化,引起細(xì)胞骨架重塑及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的改變,這也是LRRK2致病的主要機(jī)制[11]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2很可能通過調(diào)控Rho GTPases信號(hào)通路的活化而在上皮細(xì)胞吞噬功能中起重要作用。尸檢發(fā)現(xiàn)路易小體中LRRK2與α-Syn存在共定位。在α-Syn A53T轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)過表達(dá)LRRK2會(huì)加重表型及病變進(jìn)展。以上研究表明，LRRK2與α-Syn的相互作用參與了PD的發(fā)病過程。

本研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)α-Syn的吞噬與LRRK2的表達(dá)上調(diào)及Rho GTPases信號(hào)通路活化相關(guān)。由此我們認(rèn)為，LRRK2活化Rho GTPases信號(hào)通路促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬α-Syn寡聚體；調(diào)控LRRK2可能成為PD治療一個(gè)新的方向。

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(收稿2014-05-10)

The functions and mechanisms of Rho GTPases signaling pathway activation induced by LRRK2 in microglial phagocytosis of α-synuclein

DingXuebing＊,WangXuejing,MaMingming,TengJunfang

＊DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhu450052,China

Objective To investigate the mechanism of microglial phagocytosis of α-synuclein.Methods BV-2 cells activation model induced by α-synuclein oligomers was established. Immunofluorescence stain was performed to detect α-synuclein-positive inclusions in BV-2 cells. Western blot was performed to detect LRRK2 expression in BV-2 cells. Pull down was performed to detect Rho GTPases signaling pathway activation in BV-2 cells.Results Compared with the control group,α-synuclein-positive inclusions, LRRK2 expression and Rho GTPases signaling pathway activity in BV-2 cells significantly increased in theα-synuclein group.Conclusion The Rho GTPases signaling pathway activation induced by LRRK2 associate closely with microglial phagocytosis of α-synuclein.

LRRK2; Rho GTPases signaling pathway; Microglia; α-synuclein

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81301086)

R329.2

A

1673-5110(2014)23-0017-03