原發(fā)性帕金森病患者皮膚活檢術(shù)檢測(cè)自噬功能研究

王雪晶 丁雪冰 馬明明 殷競(jìng)爭(zhēng) 滕軍放(通訊作者)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

原發(fā)性帕金森病患者皮膚活檢術(shù)檢測(cè)自噬功能研究

王雪晶1，2)丁雪冰1，2)馬明明3)殷競(jìng)爭(zhēng)1，2)滕軍放1，2)(通訊作者)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

目的 運(yùn)用皮膚活檢術(shù)分別從自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬兩個(gè)方面評(píng)價(jià)原發(fā)性帕金森病(parkinson’s disease，PD)患者皮膚成纖維細(xì)胞的自噬水平的變化，初步探討自噬在PD發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 收集PD患者23例及正常對(duì)照20例皮膚標(biāo)本，并對(duì)PD病人進(jìn)行UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、Hoehn & Yahr分級(jí)法量表評(píng)分，運(yùn)用皮膚活檢術(shù)收集PD組的皮膚標(biāo)本。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain3，LC3)、Beclin-1的表達(dá)，用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值變化以及Beclin-1。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，PD患者皮膚成纖維細(xì)胞Beclin-1、LC3表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PD患者皮膚成纖維細(xì)胞巨自噬水平明顯上調(diào)，自噬水平異常調(diào)控可能參與PD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。結(jié)論 通過(guò)皮膚活檢術(shù)檢測(cè)PD患者皮膚自噬水平用于帕金森病的早期診斷具有一定的臨床價(jià)值。

帕金森??；皮膚活檢；自噬

帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是一種中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為隨意運(yùn)動(dòng)減少、行動(dòng)遲緩、靜止性震顫以及姿勢(shì)反射障礙。帕金森病的運(yùn)動(dòng)障礙主要?dú)w因于大腦中黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性缺失[1]。PD因其高致殘性、目前無(wú)法根治等特點(diǎn)，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)給患者家庭及社會(huì)都造成了負(fù)面影響。目前，診斷主要依據(jù)為所表現(xiàn)的特征典型臨床癥狀。PD起病隱襲，對(duì)于早期臨床癥狀并不典型的病人，早期臨床癥狀特異性并不強(qiáng)，且缺乏有效的早期的分子診斷標(biāo)志物，早期診斷仍比較困難[2]。自噬(autophagy)是真核細(xì)胞所特有的一種重要的高度保守的防御和保護(hù)機(jī)制，是細(xì)胞亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)的形態(tài)改變，并通過(guò)細(xì)胞溶酶體介導(dǎo)自身的大分子物質(zhì)或受損的細(xì)胞器的吞噬降解過(guò)程[3]。目前，有不少學(xué)者對(duì)自噬與PD等神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系進(jìn)行研究，但多以動(dòng)物模型、細(xì)胞培養(yǎng)以及尸解腦組織為研究對(duì)象，而在體中自噬功能的評(píng)估研究甚少[4]。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2012-06—2014-03在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的原發(fā)性PD患者23例，均符合2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)運(yùn)動(dòng)障礙與帕金森病學(xué)組制訂的帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)，未合并其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病。男13例，女10例；年齡42～64歲，平均(54.0±6.7)歲；病程2～5 a，平均(3.2±1.8)a。正常對(duì)照組20例來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科手術(shù)病人，排除神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病以及其他慢性疾病，男12例，女8例；年齡41～65歲，平均(51.9±6.9)歲。2組一般資料比較見(jiàn)表1。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者或家屬均簽署知情同意書(shū)。對(duì)所有的病人進(jìn)行詳細(xì)的病史采集，填寫(xiě)問(wèn)卷調(diào)查，包括年齡、性別、文化程度、首發(fā)癥狀及其出現(xiàn)時(shí)間、病程進(jìn)展情況、生活工作環(huán)境，有無(wú)毒物接觸史、有無(wú)家族史、有無(wú)吸煙、飲酒等嗜好；曾服用或正在服用的藥物及其服用劑量、時(shí)間，有無(wú)其他并發(fā)癥等。由研究者(神經(jīng)內(nèi)科專(zhuān)業(yè)醫(yī)師)對(duì)PD病人進(jìn)行UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、Hoehn & Yahr分級(jí)法量表。

1.2 皮膚活檢 在所有患者一側(cè)上臂背側(cè)肘關(guān)節(jié)上約10 cm處定位，用1%碘伏溶液常規(guī)消毒皮膚，2%利多卡因針對(duì)定位皮膚進(jìn)行局部浸潤(rùn)麻醉，數(shù)分鐘后選用皮膚大小合適孔徑的打孔機(jī)樣取皮器，左手固定皮膚，右手持取皮器在取材部位邊旋轉(zhuǎn)，邊向下用力，旋取5 mm×5 mm的皮膚標(biāo)本，含皮下脂肪組織及真皮層，用帶齒鑷輕輕夾起標(biāo)本并提起，用剪刀將皮膚標(biāo)本從底部剪斷，取皮過(guò)程嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求進(jìn)行，取皮后創(chuàng)口消毒、壓迫止血，用無(wú)菌紗布加壓包扎。

1.3 免疫組化法檢測(cè)皮膚組織Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的分布 皮膚標(biāo)本浸泡入4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)內(nèi)，在4℃環(huán)境下固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸潤(rùn)，石蠟包埋，后應(yīng)用組織切片機(jī)將標(biāo)本連續(xù)切片，每片厚度6 μm，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.4 免疫印跡檢測(cè)皮膚組織Beclin-1、LC3I/LC3II的表達(dá) 皮膚標(biāo)本迅速置于已編號(hào)的凍存管中，然后立即放入盛有液氮的低溫保溫瓶中，后將凍存管移入-80℃低溫冰箱中保存。將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，加入抗Beclin 1(1∶800)、抗LC3(1∶500)抗體，4℃過(guò)夜。加人過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5000)，置于水平脫色搖床上孵育1 h，TBST漂洗5次，ECL光化學(xué)法顯色。凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)皮膚組織內(nèi)源性Beclin 1 蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá) 顯微鏡觀察，每個(gè)病人皮膚樣本取5張切片，選大致相同的位置技術(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(10×40倍)，然后用數(shù)碼相機(jī)拍照。其中LC3、Beclin-1、LAMP2a免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)胞漿和胞核均呈棕褐色著色。如圖1、2所示。

圖1 免疫組化檢測(cè)皮膚組織內(nèi)源性LC3蛋白的表達(dá)

圖2 免疫組化檢測(cè)皮膚組織內(nèi)源性Belin-1蛋白的表達(dá)

2.2 免疫印跡檢測(cè)皮膚組織內(nèi)源性Beclin 1 蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，PD的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與正常對(duì)照組相比，PD的Beclin-1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 Western-blot檢測(cè)皮膚組織內(nèi)源性LC3蛋白的表達(dá)

3 討論

PD多發(fā)于中老年人，為起病隱匿的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前，PD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PD是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，環(huán)境中的神經(jīng)毒素、年齡的老化、遺傳導(dǎo)致的突變蛋白等因素均可通過(guò)導(dǎo)致線粒體功能障礙、增加細(xì)胞氧化應(yīng)激等機(jī)制誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡[5]。大量研究表明，α-synuclein蛋白的錯(cuò)誤折疊、降解障礙、異常聚集等可具有神經(jīng)毒性，影響突觸功能以及信號(hào)的傳遞，最終亦可導(dǎo)致神經(jīng)元變性，而所有的這些機(jī)制都與自噬機(jī)制緊密聯(lián)系。近期對(duì)常染色顯性和隱性遺傳家族性PD家系研究中發(fā)現(xiàn)，其相關(guān)基因產(chǎn)物也參與自噬的調(diào)控中。因此，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注自噬在PD以及其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中所起到的作用，認(rèn)識(shí)到有效的自噬調(diào)節(jié)可能成為將來(lái)PD等變性疾病治療的新突破。

自噬是真核細(xì)胞所特有的一種重要的高度保守的防御和保護(hù)機(jī)制，自噬介導(dǎo)真核細(xì)胞中長(zhǎng)半衰期蛋白、功能異?；蛉哂嗟募?xì)胞器的代謝降解。目前廣泛認(rèn)為，基礎(chǔ)水平的自噬活性在維持神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起到必不可少的作用，自噬機(jī)制的失調(diào)可導(dǎo)致神經(jīng)元變性[6]。自噬活性可多種不利條件下如營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧狀態(tài)、低能量供應(yīng)等可被誘導(dǎo)，釋放降解產(chǎn)物，尤其是氨基酸等重新進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)以供機(jī)體循環(huán)再利用。根據(jù)自噬過(guò)程中底物的種類(lèi)、底物運(yùn)送到溶酶體腔的方式不同，自噬可分為三種類(lèi)型，微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)。巨自噬特征性標(biāo)志是雙層膜自噬小體的形成，即細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生一C形雙層膜結(jié)構(gòu)，其兩端延伸形成空泡，空泡中包裹部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器或者錯(cuò)誤折疊、聚合的蛋白質(zhì)，隨后自噬小體與溶酶體融合，自噬小體內(nèi)層膜包裹的內(nèi)容物進(jìn)入溶酶體進(jìn)行降解，從而有利于一些重要的細(xì)胞成分，尤其是必需氨基酸的再循環(huán)利用。

本研究對(duì)23例PD患者的皮膚進(jìn)行活檢，并通過(guò)LC3、Beclin-1指標(biāo)來(lái)評(píng)估自噬水平，由于考慮到年齡相關(guān)的因素，我們?cè)O(shè)立了年齡匹配的有效的健康對(duì)照組，其來(lái)源主要是在燒傷科以及外科手術(shù)的無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，PD患者皮膚成纖維細(xì)胞Beclin-1、LC3II/I比值表達(dá)水平均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，間接提示PD患者體內(nèi)可能存在異常聚集、錯(cuò)誤折疊的蛋白或受損、功能異常的細(xì)胞器，從而機(jī)體通過(guò)上調(diào)自噬水平來(lái)清除降解這些異常成分，起到保護(hù)作用。自噬在PD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色，自噬上調(diào)的可能原因以及PD的發(fā)病過(guò)程中起到保護(hù)作用。

自噬調(diào)節(jié)有希望成為將來(lái)治療PD的潛在靶向目標(biāo)。目前廣泛認(rèn)為，氧化應(yīng)激在PD的發(fā)病機(jī)制中起重要的作用。許多與PD相關(guān)的基礎(chǔ)以臨床研究均發(fā)現(xiàn)自噬和氧化應(yīng)激是相互依賴(lài)的關(guān)系，從而提出通過(guò)自噬調(diào)節(jié)來(lái)抑制氧化應(yīng)激很可能成為未來(lái)治療PD的新靶點(diǎn)。自噬在多種PD模型中均證實(shí)起到保護(hù)多巴胺神經(jīng)元的作用，如通過(guò)雷帕霉素誘導(dǎo)自噬水平可有效抵抗魚(yú)藤酮導(dǎo)致的神經(jīng)毒性發(fā)揮保護(hù)作用，防止多泛素化的聚合物形成[7]。為預(yù)防對(duì)免疫系統(tǒng)有害的不良反應(yīng)，目前小劑量雷帕霉素聯(lián)合特異的抗氧化劑遏制黑質(zhì)致密部進(jìn)行性的氧化損傷已被接受。然而，另一些研究提出初級(jí)皮層神經(jīng)元中海藻糖和雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬可被巰醇抗氧化酶抑制。除此之外，一些物質(zhì)可通過(guò)抑制基礎(chǔ)自噬活性水平從而導(dǎo)致PD模型中α-synuclein蛋白聚合物的增加[8]。另外，近些年，一些學(xué)者專(zhuān)家圍繞PD治療的熱點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行研究。首先，有神經(jīng)病理學(xué)分析和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明注射Beclin-1可促進(jìn)邊緣系統(tǒng)中α-synuclein蛋白的清除，可能成為治療PD的創(chuàng)新性方法。其次，研究發(fā)現(xiàn)，敲除Rab1a基因可抑制自噬小體形成，促進(jìn)α-synuclein蛋白的異常聚積[9]。因此，若Rab1的基因表達(dá)水平調(diào)控適當(dāng)，從而可能啟動(dòng)自噬途徑，加速異常聚積α-synuclein蛋白的清除。

綜上所述，PD的病因、發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，多種機(jī)制相互作用參與其發(fā)病及發(fā)展過(guò)程中。本研究并不拘泥于某一種機(jī)制與自噬的關(guān)系，而從宏觀上觀察自噬活性在活體患者中的水平，并對(duì)造成這種現(xiàn)象的可能原因進(jìn)行分析，對(duì)自噬在PD發(fā)病中的所扮演的角色有了初步了解。但這些復(fù)雜的機(jī)制如何調(diào)控自噬活性，其生物學(xué)意義是什么以及自噬發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用的具體機(jī)制如何，都需要有更多更深入樣本量更大的研究來(lái)進(jìn)一步發(fā)掘驗(yàn)證，為將來(lái)尋找PD有效可行的生物學(xué)標(biāo)志物及開(kāi)發(fā)治療這些疾病的新手段奠定理論基礎(chǔ)。

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(收稿2014-05-15)

Skin biopsy for assessment of autophagy dysregulation in the pathogenesis of Parkinson’s disease

WangXuejing＊,DingXuebing,MaMingming,YinJingzheng,TengJunfang

＊DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003,China

Objective To assessment the function of chaperone-mediated autophagy (CMA), and macroautophagy in Parkinson’s disease patients using skin biopsy, and explore the role of autophagy in pathogenesis of Parkinson’s disease. Methods The study samples included 23 PD patients and 20 normal controls. Clinical data of all PD patients were collected, and graded by UPDRSⅡ, Hoehn & Yahr scales. Punch skin biopsies were taken from PD patients. Skin biopsy specimens were immunohistochemically stained with anti-LC3, anti-Beclin-1 and anti-LAMP2a antibodies. The expression of microtubule-associated protein1 light chain 3(LC-3), beclin-1, heat shock cognate protein70 (HSC-70), lysosome-associated membrane protein 2a (LAMP2a) were detected by Western blot.Results Beclin-1, LC3 immune positive cells optical density value in skin fibroblasts of PD was significantly more than that of the healthy controls(P<0.05). Western blot result showed LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, Beclin-1 expression was significantly higher than that of control subjects(P<0.05).Conclusion Macroautophagy activity was higher in PD patients’ fibroblasts, and dysregulation of macroautophagy may participate in the process of PD.

Parkinson’s disease; Skin biopsy; Autophagy

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81100949，81301086)

R742.5

A

1673-5110(2014)23-0010-03