大面積腦梗死患者血清let-7f表達的初步研究

龔 哲 趙紹云 張 靜 徐小隔 何 霞 鄧文靜 牛瑞娜 滕軍放 賈延劼

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

大面積腦梗死患者血清let-7f表達的初步研究

龔 哲1，2)趙紹云1，2)張 靜1，2)徐小隔1，2)何 霞1)鄧文靜1)牛瑞娜1)滕軍放1)賈延劼1)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室 鄭州 450052

目的 本研究擬初步探討let-7f與大面積腦梗死的診斷及發(fā)展的相關(guān)性。方法 采用前瞻性隊列研究方法，收集神經(jīng)重癥ICU的缺血性腦卒中患者血標(biāo)本(128例)，并收集年齡、性別匹配的正常人群、腦出血患者作為對照。將血清標(biāo)本進行miRNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR，以檢測血清中l(wèi)et-7f的相對表達量。結(jié)果 血清let-7f在大面積前循環(huán)腦梗死患者中表達較正常人群顯著下調(diào)(P<0.05)；在后循環(huán)腦梗死患者中的表達水平較正常人群無顯著性差異。血清let-7f在大面積腦梗死合并出血轉(zhuǎn)化患者中表達較正常人群顯著上調(diào)(P<0.05)，但較腦出血患者無顯著性差異。血清let-7f在腦出血患者中的表達水平較正常人群顯著上調(diào)(P<0.05)。血清let-7f在非大面積腦梗死患者中的表達水平較正常人群顯著上調(diào)(P<0.05)，但低于腦出血患者。血清let-7f表達水平與肺部感染無顯著性差異(P>0.05)。血清let-7f與腦出血或腦梗死合并出血呈高度正相關(guān)性，其次與梗死面積呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 血清let-7f表達水平對于大面積前循環(huán)腦梗死的診斷及發(fā)展具有一定的相關(guān)性。

let-7f；大面積腦梗死；腦出血

大面積腦梗死是腦梗死中較嚴(yán)重的類型，是指腦主干動脈狹窄、閉塞導(dǎo)致相應(yīng)供血區(qū)域腦組織的梗死，約占腦梗死的10%，以發(fā)病突然、進展快為特點，并常出現(xiàn)顱高壓、意識障礙，通常病情危重。然而，目前臨床上用于診斷及評價大面積腦梗死預(yù)后的方法多局限在影像學(xué)，缺乏相應(yīng)的新的生物學(xué)指標(biāo)。microRNA是一種微小的非編碼RNA，被認(rèn)為用于調(diào)節(jié)基因表達的內(nèi)在生物因子，也因在某些病理生理過程中起到重要作用而被大家認(rèn)識，如腫瘤發(fā)生、增殖作用、造血作用、代謝作用、炎癥反應(yīng)、胚胎生成及神經(jīng)退行性疾病等。同時，microRNA也被發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤病因?qū)W及一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷方面具有重要意義。其中l(wèi)et-7f因在腫瘤[1]、免疫性疾病[2-4]及神經(jīng)退行性疾病[5-7]中的表達具有特異性改變而受到關(guān)注。本研究擬初步探討let-7f與大面積腦梗死的診斷及發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用前瞻性隊列研究方法，連續(xù)收集2013-07—2014-06入神經(jīng)重癥ICU的缺血性腦卒中患者128例，男73例，女55例；年齡35～86歲，平均60歲，其中30～40歲 15例，>40～50歲 28例，>50～60歲 39例，>60～70歲 36例，70歲以上 10例。按照牛津郡社區(qū)卒中規(guī)劃(OCSP)分型，完全前循環(huán)梗死57例，部分前循環(huán)梗死26例，后循環(huán)梗死34例，腔隙性梗死11例。根據(jù)收集標(biāo)本時患者的病情進行mRS評分，完全前循環(huán)梗死患者(55例)均mRS≥4，部分前循環(huán)梗死患者15例mRS≥4，后循環(huán)梗死患者20例mRS≥4，余患者mRS<3。

根據(jù)影像學(xué)將腦梗死面積直徑>4.0 cm或梗死灶波及2個腦葉以上者歸為大面積腦梗死組(88例)，即A組，其中前循環(huán)梗死患者歸為A1組(63例)，后循環(huán)梗死患者歸為A2組(25組)，非大面積腦梗死歸為B組(40例)，根據(jù)是否合并出血或肺部感染進行再分組。同時收集年齡、性別匹配的正常人群45例，腦出血患者20例作為對照(見表1)。

表1 患者一般資料比較

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑：miRNA提取分離試劑盒購自北京康為公司，Reverse Transcriprition System(A3500)、Gotaq qPCR Master Mix(A6001)購自Promega公司，let-7f引物購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2.2 血清標(biāo)本的收集：抽取患者外周血，收集于無抗凝劑管中，于4℃ 592.5×g 離心15 min，提取上層血清于EP管中置于-80℃冰箱備用。

1.2.3 血清micro RNA的提取：按照miRNA提取分離試劑盒(北京康為公司)說明書提取血清中micro RNAs。

1.2.4 RT-PCR：根據(jù)Reverse Transcription System說明書，將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照Gotaq qPCR Master Mix說明書進行熒光定量檢測，以5S為內(nèi)參。記錄相應(yīng)的Ct值，miRNA相對表達量采用公式2-△△Ct方法計算，所有樣本重復(fù)3次，整個實驗采用盲法。根據(jù)大面積腦梗死患者的miRNA表達水平回顧性隊列研究大面積腦梗死患者的預(yù)后情況，登記生存時間。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 實時定量PCR的大面積腦梗死組、非大面積腦梗死組、腦出血組、正常對照組(見表2)，各組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 患者一般資料比較

注：年齡與實驗組比較，*#△P>0.05；性別比例與實驗組比較，*#△P>0.05

2.2 血清中l(wèi)et-7f在各實驗組及對照組中的相對表達量及相關(guān)性 結(jié)果顯示(見圖1)：血清let-7f在大面積前循環(huán)腦梗死患者中表達較正常人群、腦出血患者顯著下調(diào)(P<0.05)；在后循環(huán)腦梗死患者中的表達水平較正常健康人群無顯著性差異，與前循環(huán)腦梗死、腦出血患者有顯著性差異(P<0.05)。同時，血清let-7f在大面積腦梗死合并出血轉(zhuǎn)化患者中表達較正常人群、非出血大面積腦梗死患者顯著上調(diào)(P<0.05)，但較腦出血患者無顯著性差異。血清let-7f在腦出血患者中的表達水平較正常健康人群、大面積腦梗死、非大面積腦梗死患者顯著上調(diào)(P<0.05)。血清let-7f在非大面積腦梗死患者中的表達水平較正常健康人群、大面積腦梗死患者顯著上調(diào)(P<0.05)，但低于腦出血患者。血清let-7f表達水平與是否肺部感染無顯著性差異(P>0.05)。血清let-7f與腦出血或腦梗死合并出血呈高度正相關(guān)性，其次與梗死面積呈負(fù)相關(guān)(見表3)。

注：a表示大面積前循環(huán)腦梗死，a’表示大面積后循環(huán)腦梗死，b表示非大面積腦梗死，c表示腦出血或合并出血，d表示合并肺部感染，NC表示正常健康組。1組表示單純大面積前循環(huán)腦梗死組，2組表示大面積前循環(huán)腦梗死合并腦出血組，3組表示大面積前循環(huán)腦梗死合并肺部感染組，4組表示大面積前循環(huán)腦梗死合并腦出血及肺部感染組，5組表示單純大面積后循環(huán)腦梗死組，6組表示大面積后循環(huán)腦梗死合并腦出血組，7組表示大面積后循環(huán)腦梗死合并肺部感染組，8組表示大面積后循環(huán)腦梗死合并腦出血及肺部感染組，9組表示單純非大面積腦梗死組，10組表示非大面積腦梗死合并腦出血組，11組表示非大面積腦梗死合并肺部感染組，12組表示非大面積腦梗死合并腦出血及肺部感染組，13組表示單純腦出血組，14組表示腦出血合并肺部感染組

圖1 血清中l(wèi)et-7f在各實驗組及對照組中的相對表達量比較

表3 血清中l(wèi)et-7f與各類相關(guān)因素的相關(guān)性

3 討論

大面積腦梗死是腦梗死中較嚴(yán)重的類型，病情兇險，病死率和致殘率均很高。定義目前尚無統(tǒng)一明確的標(biāo)準(zhǔn)，有人認(rèn)為腦梗死面積直徑>4.0 cm或梗死面波及2個腦葉以上者,也有人稱腦梗死波及范圍大于同側(cè)1/2或2/3的面積[8]。我們采用了前者，即梗死面積直徑>4.0 cm或梗死面波及2個腦葉以上的標(biāo)準(zhǔn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清let-7f在大面積前循環(huán)腦梗死患者中表達較正常人群顯著下調(diào)，其mRS多≥4分，可鑒別于其他腦血管疾病，如腦出血及非小面積腦梗死，且腦梗死后出血性轉(zhuǎn)化患者中l(wèi)et-7f的表達水平與腦出血患者表達水平無明顯差異，較正常人水平上調(diào)，因此，檢測血清let-7的表達水平對于診斷大面積前循環(huán)腦梗死及是否合并出血性轉(zhuǎn)化的疾病發(fā)展過程亦有診斷意義，考慮與炎癥反應(yīng)、血管再生、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及神經(jīng)保護作用等有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，let-7f與炎癥反應(yīng)有關(guān)，其水平與Blimp-q的表達有一定相關(guān)性。Blimp-1對IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-6等促炎因子的抑制作用[9-10]，而敲除let-7f基因可導(dǎo)致Blimp-1表達增加，let-7f的過表達可抑制Blimp-1的表達，故let-7f可提高促炎因子的釋放。然而，在大面積腦梗死患者發(fā)病后數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)，其活化的T淋巴細(xì)胞減少且外周免疫器官會處于“腦梗死后免疫缺陷狀態(tài)”[11]，可考慮let-7f表達水平的下降與此相關(guān)。

Let-7f與組織血管再生及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在青年卒中患者中，血清let-7f與腦梗死后血管內(nèi)皮增殖及血管再生有關(guān)，且在惡性腫瘤中，let-7f可促進腫瘤組織中血管生成[12-14]。而大面積腦梗死患者發(fā)病多與房顫等冠心病有關(guān)，Yamanouchi等[15-16]報道了3408例65歲以上的連續(xù)老年尸檢材料，在132例大面積腦梗死病例中，86例由心源性腦梗死引起，只有34例為血栓形成或其他梗死原因引起，即大面積腦梗死患者多為頸內(nèi)動脈或大腦中動脈急性閉塞，或在原有血管狹窄的基礎(chǔ)上急性閉塞，顱內(nèi)血管再生過程尚未發(fā)生。

Let-7f的下游基因眾多，其中包括很多與腦梗死相關(guān)的基因，如AMOT(血管動蛋白)、IGF、ESM1、VPS26B等。研究表明，絕經(jīng)后女性的let-7f水平升高，IGF-1水平降低[17]，應(yīng)用let-7f拮抗劑后可有效升高IGF-1水平，提高腦梗死后神經(jīng)保護作用[18]，可考慮在非大面積腦梗死患者中應(yīng)用let-7f拮抗劑可能改善腦梗死預(yù)后。

目前大面積前循環(huán)腦梗死患者血清中l(wèi)et-7f表達水平改變的機制尚不完全明確，但根據(jù)本研究結(jié)果，let-7f的表達水平改變對于診斷大面積前循環(huán)腦梗死及是否合并出血性轉(zhuǎn)化的疾病發(fā)展過程具有診斷意義，有望成為其新的生物學(xué)標(biāo)記物。

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(收稿2014-05-20)

The primary research of let-7f’s expression in serum in large area cerebral infarction

GongZhe＊,ZhaoShaoyun,ZhangJing,XuXiaoge,HeXia,DengWenjing,NiuRuina，TengJunfang,JiaYanjie

＊DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

Objective To investigate the correlation between the expression of let-7f in serum and the diagnosis and the development of large area cerebral infarction.Methods Prospective cohort study was used to collect the ischemic stroke patients blood samples (128 cases) in neurological ICU, and the serum of normal people and cerebral hemorrhage patients whose age and sex were matched.The relative expression of let-7f in plasma was checked by managing the serum samples by miRNA extraction, reverse transcription and quantitative real-time PCR.Results The expression of let-7f in patients of pre-cycle massive cerebral infarction was significantly lower than normal population (P<0.05); the expression of let-7f in pro-cycle massive cerebral infarction patients had no significant difference compared with the normal population.The expression of let-7f in patients of hemorrhagic infarction patients was significantly higher than the normal population(P<0.05), which had no difference compared with encephalorrhagia.The expression of let-7f in patients of encephalorrhagia was significantly higher than normal population (P<0.05).The expression of let-7f in non-massive cerebral infarction patients was significantly higher than the normal population(P<0.05), which was lower than the patients of encephalorrhagia.The expression of let-7f had no significant correlation(P>0.05).The expression of let-7f in serum had a highly positive correlation compared with hemorrhagic infarction and encephalorrhagia, and was negatively correlated with the infarct area.Conclusion The expression of let-7f in serum is meaning for the diagnosis and the development of large area cerebral infarction.

let-7f; Large area cerebral infarction; Encephalorrhagia

國家自然科學(xué)基金(編號：81371385)

R743.33

A

1673-5110(2014)23-0008-03