乙型肝炎病毒外膜大蛋白檢測的應(yīng)用價(jià)值及其研究進(jìn)展

劉金濤

(呼和浩特市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010031)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是已知感染人類最小的DNA病毒。HBV感染不僅可以引起急性乙型病毒性肝炎(acute hepatitis B，AHB)、慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，還與肝硬化(liver cirrhosis，LC)、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年隨著對(duì)HBV外膜大蛋白(large surface protein，LP)在HBV感染、復(fù)制及用于制備重組疫苗［1-2］、藥物［3］等方面的探究，使其作為新的、更有價(jià)值的、可靠的乙型肝炎抗病毒治療(antiviral treatment for hepatitis B，ATHB)監(jiān)測的血清免疫學(xué)指標(biāo)之一，受到臨床廣泛關(guān)注。

一、HBV-LP是唯一一種具雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、致肝細(xì)胞毒性、能反式激活增強(qiáng)病毒復(fù)制作用的外膜蛋白

1.HBV-LP獨(dú)特雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是其發(fā)揮多種功能作用依賴性結(jié)構(gòu) HBV的3個(gè)外膜蛋白是從一個(gè)ORF的3個(gè)不同起始位點(diǎn)與相同終止位點(diǎn)翻譯表達(dá)而來。HBV外膜蛋白不僅能組裝成病毒包膜，還能組裝成不含有核酸的小球形顆粒和亞病毒管狀顆粒(subviral particles，SVPs)。HBV感染人體后在血清中以此3種病毒顆粒不同比例存在。在肝內(nèi)病毒非復(fù)制期HBV-LP在血清中很低或無，大量滯留在肝細(xì)胞中。在病毒粒子成熟過程中HBV-LPPreS結(jié)構(gòu)域停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)胞質(zhì)面，通過S結(jié)構(gòu)Ⅱ型信號(hào)和疏水C端跨過ER膜，約50%HBVLP跨膜區(qū)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在翻譯后發(fā)生改變，使PreS區(qū)域暴露于病毒粒子表面，從而產(chǎn)生HBVLP獨(dú)特立體構(gòu)象雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

2.HBV-LP是致肝細(xì)胞損傷、死亡和纖維化病變主因 HBV-LP存在于Dane顆粒和SVPs上，是病毒形成完整外膜重要標(biāo)志，與病毒復(fù)制、病毒顆粒組裝和從細(xì)胞內(nèi)釋放調(diào)節(jié)密切相關(guān)?？筛鶕?jù)HBV-LP有無來判斷HBV攜帶者體內(nèi)的HBV是否在進(jìn)行復(fù)制。HBV-LP轉(zhuǎn)錄激活功能是由PreS2區(qū)域細(xì)胞質(zhì)定位所產(chǎn)生的，可能使HBV攜帶者患HCC的可能性增大。目前認(rèn)為HCC發(fā)展是由體內(nèi)HBV-LP連續(xù)過表達(dá)造成的，過量HBV-LP在肝細(xì)胞ER積聚是導(dǎo)致ER應(yīng)急的關(guān)鍵因素［4］，并導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性甚至致癌。在對(duì)肝細(xì)胞有直接毒性作用的HBV表達(dá)抗原中只有HBV-LP有直接肝細(xì)胞毒性。毛玻璃樣變是感染HBV晚期非復(fù)制狀態(tài)肝細(xì)胞典型形態(tài)學(xué)特征，PreS1和PreS2區(qū)突變導(dǎo)致乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)在ER滯留并誘導(dǎo)ER應(yīng)激。HBV-LP的過表達(dá)導(dǎo)致一些控制細(xì)胞增殖的激酶［蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、c-Raf-1激酶］的活化，這些酶的連續(xù)活化可能與HCC的發(fā)生有一定的相關(guān)性。據(jù)癌癥發(fā)生機(jī)制多因子模型，HBV-LP連續(xù)表達(dá)也可能具腫瘤促發(fā)功能。有研究表明，HBV-LP通過觸發(fā)PKCα/RAF1 SRC/PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生，這是揭示HBV相關(guān)HCC發(fā)病機(jī)制的新見解［5］。

3.HBV-LP的多功能性 由病毒編碼的蛋白和蛋白結(jié)構(gòu)域都具多種功能，HBV-LP亦是。HBV感染通常導(dǎo)致超過104倍病毒粒子SVPs的合成。SVPs包含宿主細(xì)胞來源的脂質(zhì)和病毒衣殼蛋白，不具有核衣殼和核酸。HBV的衣殼HBV-LP在病毒生活周期中具有一系列不同的功能，可致病毒復(fù)制激活［6］。感染早期與細(xì)胞受體結(jié)合介導(dǎo)病毒粒子的細(xì)胞內(nèi)攝入;感染晚期其對(duì)于病毒粒子的組裝和分泌十分重要。HBV-LP的PreS1區(qū)和PreS2區(qū)有一個(gè)與翻譯不同步的轉(zhuǎn)位過程，在橫跨ER膜時(shí)指向ER的胞質(zhì)側(cè)，HBV-LP上的PreS2區(qū)段在翻譯后初期定位于ER的胞質(zhì)側(cè)，能夠激活多種啟動(dòng)子元件，具同樣轉(zhuǎn)錄激活功能。HBV-LP在病毒進(jìn)入肝細(xì)胞時(shí)作為受體蛋白起作用，在病毒組裝時(shí)則是基質(zhì)類似蛋白，同時(shí)還行使調(diào)節(jié)功能，這種多功能性依賴于 HBV-LP PreS區(qū)獨(dú)特的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。有學(xué)者通過鴨肝模型研究發(fā)現(xiàn)，含有嗜肝病毒血清的感染性大小依賴于具有感染性的Dane顆粒的多少，還依賴于缺乏核酸、富含HBV-LP的亞病毒顆粒的數(shù)量，后者主要包括管狀顆粒和小球形顆粒，這些顆粒有反式激活作用，能顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制和基因表達(dá)［7］。有研究表明HBV-LP超量表達(dá)會(huì)通過反式調(diào)控作用使SVPs不會(huì)分泌，形成亞病毒包膜纖維體，其在細(xì)胞內(nèi)積累可導(dǎo)致肝細(xì)胞液泡化和細(xì)胞凋亡。

二、HBV-LP檢測的臨床應(yīng)用價(jià)值

1.HBV-LP是從蛋白水平進(jìn)行患者機(jī)體內(nèi)病毒復(fù)制監(jiān)測及療效判斷的良好指標(biāo)之一 HBVLP檢測對(duì)隱匿性HBV感染具重要價(jià)值［8］，有研究表明HBV-LP的敏感性和特異性分別為64.89%和99.68%，HBV DNA的敏感性和特異性分別為60.63%和 100.00%(P＜0.05)［9］。HBV-LP作為判斷HBV復(fù)制水平指標(biāo)，并參與對(duì)肝細(xì)胞的損傷［10］。HBV-LP PreS區(qū)具有的較復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)致PreS1檢出率較低，不能很好地反映HBV復(fù)制情況。對(duì)乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)陰性患者HBV復(fù)制的評(píng)估是臨床亟需解決的課題之一，HBV-LP對(duì)于判斷HBeAg陰性患者體內(nèi)復(fù)制具重要臨床意義，是反映HBeAg陰性和低水平HBV DNA患者體內(nèi)病毒復(fù)制、疾病進(jìn)程、療效與預(yù)后判斷的敏感指標(biāo)。由于持續(xù)免疫壓力、長期治療，HBV preC基因1896位發(fā)生G→A點(diǎn)突變，產(chǎn)生了一個(gè)新終止密碼子(TAG)，阻斷了HBeAg形成致臨床發(fā)生HBeAg陰性，HBV DNA下降趨于轉(zhuǎn)陰，難以依據(jù)HBeAg確定治療時(shí)機(jī)［11］。新近研究也表明 HBV-LP與HBV 感染、復(fù)制及預(yù)后密切相關(guān)［12］，較 PreS1、PreS2、HBV DNA、HBeAg 敏感［13］。我國 10% 人群攜帶 HBV，其中10%～20%可發(fā)展為LC，HBeAg陰性CHB患者在不斷增加，我國CHB患者尤其是LC患者中HBeAg陰性者高達(dá)60%以上［14］，探索簡單、低廉判定HBV復(fù)制血清學(xué)指標(biāo)成為研究熱點(diǎn)之一。HBV-LP與HBV DNA在HBeAg陰性者中具較大差異［15］，HBV-LP與HBV DNA對(duì)乙型肝炎診治及預(yù)后評(píng)估有互補(bǔ)作用［16］。對(duì)于抗HBe患者，因HBV DNA量與CHB肝臟炎癥程度無關(guān)，定期開展聯(lián)檢，結(jié)合肝功能等進(jìn)行綜合評(píng)判肝損情況是進(jìn)行科學(xué)合理治療的根本。HBV-LP、HBV DNA及HBV血清標(biāo)志物聯(lián)檢有助于疾病診斷、療效觀察及預(yù)后判斷［17］。有研究表明HBV-LP與突變患者和非突變的患者HBV DNA水平呈正相關(guān)［18］，表明患者體內(nèi)HBVLP與病毒復(fù)制程度密切相關(guān)，而且不受 HBV YMDD變異的影響。

2.HBV-LP有望成為新的更有價(jià)值的ATHB監(jiān)測指標(biāo) 目前ATHB只能抑制共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)再復(fù)制，并不能抑制已經(jīng)形成的病毒表達(dá)蛋白，富含HBV-LP亞病毒顆粒在一段時(shí)間內(nèi)仍存在。動(dòng)態(tài)監(jiān)測HBV-LP可作為病毒復(fù)制和療效判定的重要指標(biāo)［20-21］。臨床針對(duì)HBV感染、復(fù)制、療效觀察和預(yù)后判斷等血清學(xué)指標(biāo)很多，但均具一定局限性。HBV DNA拷貝數(shù)和HBV-LP水平具良好相關(guān)性［19］。因HBV基因變異頻繁，HBV-LP可彌補(bǔ)由 HBV變異引起的HBeAg檢測不足［22］，在一定程度上反映了乙型肝炎患者肝功能狀況［23］。HBeAg轉(zhuǎn)陰、抗 HBe陽性患者仍存在病毒復(fù)制，對(duì)于HBeAg陰性CHB患者，HBV-LP檢測反映病毒復(fù)制優(yōu)于 HBV DNA，HBV-LP有指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后的作用［24］，二者具互補(bǔ)作用，甚至在基層可替代HBV DNA測定［25］。HBV-LP利于對(duì)CHB預(yù)后監(jiān)測，防止或延緩LC或HCC的發(fā)生、發(fā)展，是監(jiān)測HBeAg陰性HBV感染者病毒復(fù)制、病情進(jìn)程，判斷療效、預(yù)后及ATHB效果的敏感指標(biāo)，可提高乙型肝炎患者血清學(xué)診斷水平［26］。HBV-LP尚不能完全代替HBV DNA的檢測來反映HBV復(fù)制情況，但可作為HBV DNA的有效補(bǔ)充和加強(qiáng)［27-28］。HBV血清標(biāo)志物模式多樣且復(fù)雜，HBV-LP在HBV感染、復(fù)制和刺激機(jī)體免疫應(yīng)答方面均起重要作用。HBV血清標(biāo)志物與HBV DNA的復(fù)制表達(dá)差別較大，HBV血清標(biāo)志物陽性者無論何種組合模式均存在病毒復(fù)制的可能，HBV-LP是HBV血清標(biāo)志物較好的補(bǔ)充［29］。不同肝病病種中HBV-LP有差異性［30］。由于機(jī)體對(duì)HBV免疫應(yīng)答是造成肝組織破壞和肝功能損害的主要機(jī)制，不能完全以HBV DNA來判斷患者肝功能好壞。在條件有限的實(shí)驗(yàn)室，尤其是HBeAg陽性患者如不具HBV DNA檢測條件可通過PreS1和抗HBV核心抗體IgM(HBcIgM)判定HBV復(fù)制及肝損。HBV-LP反映HBV復(fù)制對(duì)ATHB更具重要價(jià)值，是ATHB中的CHB患者的病程、療效與預(yù)后判斷的重要指標(biāo)［31］。拉米夫定對(duì)CHB HBV DNA的殘留陽性也意味著肝細(xì)胞內(nèi)殘留病毒的高復(fù)制能力。拉米夫定雖能明顯降低HBV DNA水平，使丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶恢復(fù)正常，但治療停藥時(shí)間很難把握，即使部分病例按臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見停藥，仍出現(xiàn)病毒復(fù)發(fā)。隨著ATHB手段的不斷發(fā)展，原有監(jiān)測指標(biāo)已不能滿足醫(yī)患雙方對(duì)CHB治療結(jié)果評(píng)估的需要，HBV DNA陰轉(zhuǎn)、HBeAg陰轉(zhuǎn)不表示病毒停止復(fù)制［32］，有部分患者慢慢發(fā)展成為LC或HCC。ATHB中動(dòng)態(tài)檢測HBV-LP可用于評(píng)估抗病毒療效［14，20］，不論其檢測方法還是臨床應(yīng)用都具其獨(dú)特優(yōu)越性。但HBV-LP是否能夠作為HBeAg陰性ATHB終點(diǎn)的有效判定指標(biāo)，尚待進(jìn)一步探討［33］。有研究表明HBeAg陰性患者血清HBV-LP水平(≥3.889 mg/mL)在基線水平不應(yīng)該被建議接受阿德福韋酯治療［34］。

3.對(duì)HBV-LP高含量母親的新生兒采取更有效措施是密切需要解決的問題 正確評(píng)估HBV宮內(nèi)感染率將有助重新認(rèn)識(shí)HBV宮內(nèi)感染問題的嚴(yán)重性，HBV攜帶者孕婦不同HBV-LP可反映其傳染性強(qiáng)弱，進(jìn)而估計(jì)HBsAg陽性孕婦胎兒發(fā)生宮內(nèi)感染危險(xiǎn)性的高低［35］。攜帶HBV的孕婦尤其是HBsAg和HBeAg陽性孕婦，其子代感染風(fēng)險(xiǎn)約為88%～90%。我國每年約150萬HBV攜帶者分娩，約80萬兒童可能通過母嬰垂直傳播被感染。如不加預(yù)防，這些子代幾乎全部將在出生后1年內(nèi)成為HBsAg陽性HBV攜帶者。嬰幼兒期感染建立了免疫耐受，感染者往往成為慢性甚至終身HBV攜帶者，易致LC甚或HCC。新生兒使用聯(lián)合免疫后，母親HBV-LP量仍影響著新生兒免疫效果。HBV宮內(nèi)感染已成為乙型肝炎高發(fā)區(qū)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題［36］。

4.HBV-LP可廣泛應(yīng)用于公共體檢領(lǐng)域HBV-LP作為判斷肝內(nèi)病毒繼續(xù)復(fù)制或復(fù)制活躍程度的指標(biāo)，在出國勞務(wù)人員健康體檢中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，有助于體檢單位評(píng)價(jià)體檢者的健康狀態(tài)［37-38］。

三、HBV-LP研究進(jìn)展

1.檢測技術(shù)的進(jìn)展 20世紀(jì)80年代HBVLP PreS與HBV復(fù)制關(guān)系已引起廣泛關(guān)注，其意義得到公認(rèn)。但檢測手段缺乏，應(yīng)用不廣。20世紀(jì)90年代從蛋白組成上認(rèn)為PreS1是HBV-LP所獨(dú)有，其作為新標(biāo)志一直是HBV檢測領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，PreS區(qū)研究是將PreS1和PreS2作為獨(dú)立單元進(jìn)行的。90年代中期，我國已有PreS商品化定性試劑，僅能檢測到微弱抗PreS1產(chǎn)生。90年代末，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬賢凱等使用基因重組PreS制備多抗組裝成試劑盒，在HBsAg、HBeAg、抗HBc均陽性及HBsAg、抗HBe、抗 HBc均陽性中檢出率無顯著差異，與HBV復(fù)制的相關(guān)性也不夠高。由于HBV-LP表達(dá)具有很強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)滯留性，HBV-LP PreS難以體外重組表達(dá)，同時(shí)該HBV-LP極容易降解，將HBV-LP PreS區(qū)作為一個(gè)整體對(duì)其蛋白功能研究相對(duì)較少。國內(nèi)近期才有完整表達(dá)PreS區(qū)抗原的成功［39］。國外對(duì)于S區(qū)抗原檢測研究始于1984年，Klaus等用HBV感染者的血清分離出HBV顆粒，分離出一株P(guān)reS1區(qū)線性表位aa31-33區(qū)段的單抗，但未在臨床診斷中應(yīng)用。90年代至今，針對(duì)PreS區(qū)蛋白整體性構(gòu)象型蛋白研究日益受到重視。有研究證明HBV-LPPreS區(qū)具HBsAg眾多免疫表位，由HBVLP組裝成的亞病毒顆粒能夠反式激活病毒繼續(xù)復(fù)制，有相關(guān)乙型肝炎鴨模型證實(shí)，這對(duì)臨床具實(shí)際意義。臨床上一定比例［HBsAg、抗 HBe、抗HBc均陽性］患者ATHB后(HBV DNA低拷貝數(shù))存在亞病毒顆粒［PreS(陽性)］。對(duì)HBV外膜蛋白深入研究發(fā)現(xiàn)HBV-LP在完整病毒外殼組裝過程中起著決定性作用。整個(gè)PreS區(qū)都暴露在病毒顆粒的表面，HBV-LP在穿越ER時(shí)需要形成雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，HBV-LP折疊使PreS區(qū)形成一個(gè)結(jié)構(gòu)型依賴的區(qū)域。表位構(gòu)成方式至少有2種:線性表位和構(gòu)象表位。病毒抗原的免疫檢測研究中，大多都采用病毒的部分基因重組抗原或合成多肽制作的單抗。近年逐漸認(rèn)識(shí)到合成多肽一般只具線性表位，而不具抗體所識(shí)別的構(gòu)象型表位。當(dāng)病毒優(yōu)勢(shì)抗原表位是具有立體空間構(gòu)象型的抗原表位時(shí)，采用基因重組或合成肽的抗原制作的單抗其檢測病毒抗原的敏感性必定受到影響，最好的辦法是采用病毒樣顆粒上天然抗原決定簇或能模擬其結(jié)構(gòu)的重組蛋白來制作出針對(duì)其構(gòu)象型表位的單克隆抗體。針對(duì)HBV-LP拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特異性單抗是檢測HBV-LP的較好選擇。近年通過蛋白修飾等技術(shù)已可在體外完整表達(dá)并純化出HBV-LP，從而使HBV-LP相關(guān)功能研究成為可能。

2.最新研究成果 HBV感染與HCC高度相關(guān)。Dorobantu等［40］報(bào)道膽固醇在維持 HBV-LP獨(dú)特的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上是非常重要的，這是病毒外膜的關(guān)鍵。而α-酸性葡萄糖苷酶代謝異常是惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志［41］，這些研究表明了HBV-LP受脂類、碳水化合物代謝的影響。HBV-LP PreS突變被認(rèn)為是HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌變的關(guān)鍵。研究結(jié)果強(qiáng)烈表明，HBV與C53的結(jié)合是一個(gè)新的負(fù)調(diào)節(jié)點(diǎn)反應(yīng)，這可能是引起HCC的HBV潛在的新機(jī)制［42］。Mun 等［43］揭示 F141L 在HBV-LP 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化中起重要作用，F(xiàn)141L突變可作為HCC診斷標(biāo)志物。以往的研究表明HBV PreS2變異是一個(gè)重要的發(fā)展成HCC的風(fēng)險(xiǎn)，但其與化療藥物治療間的關(guān)系仍不清楚，Hung等［44］的結(jié)果提示，HBV PreS2在增加 Bcl-2的表達(dá)中起著重要作用，這提供了一個(gè)重要的HBV PreS2相關(guān)腫瘤化療策略。為了阻止病毒進(jìn)入，幾個(gè)基于?；疨reS1抗原衍生肽和短PreS1蛋白結(jié)合肽的方法目前正在研究中，已成為新的抗病毒治療靶點(diǎn)［45］。

目前臨床檢測HBV復(fù)制的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)各有其臨床意義，但是他們或缺乏特異性，或較難在基層醫(yī)院普及和推廣。廣泛使用的抗病毒藥物雖有一定療效，尚無有效合理評(píng)價(jià)療效的指標(biāo)，無法確定停藥時(shí)間，停藥后是否會(huì)復(fù)發(fā)或反彈亦缺乏有效預(yù)示指標(biāo)。隨著HBV-LP在乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、感染與病毒復(fù)制等方面研究地逐漸深入，以及分子生物學(xué)、免疫學(xué)和計(jì)算機(jī)等技術(shù)的迅速發(fā)展，HBV-LP具有越來越重要的臨床價(jià)值，為積極尋找臨床隱匿性HBV感染的檢測策略提供了血清學(xué)參考。

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