基于錨定PCR技術(shù)對(duì)10種重要農(nóng)業(yè)害蟲微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的篩選及其特征分析

李 慧， 郎坤玲， 沈長(zhǎng)朋， 李 潔， 陶云荔， 褚 棟

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院,山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266109

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)一般指基因組中由短的重復(fù)單元(一般為1～6個(gè)堿基)組成的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSRs)。微衛(wèi)星DNA廣泛分布于真核生物的基因組中，在原核生物的基因組中也有少量分布(羅文永等，2003)。微衛(wèi)星DNA符合孟德爾遺傳模式，共顯性遺傳，通常具有豐富的多態(tài)性，易于檢測(cè)，是一類很好的分子標(biāo)記(代金霞，2005；何平，1998；劉佳妮等，2008)。微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)已被應(yīng)用于入侵害蟲的起源、入侵途徑及模式和種群擴(kuò)散等研究中(褚棟等，2007、2012；高長(zhǎng)生等，2011；Chuetal.，2011)。

微衛(wèi)星DNA的獲得方式主要有幾種途徑：(1)篩選基因文庫(kù)法，用含有微衛(wèi)星的探針在基因文庫(kù)中篩選含有微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆并測(cè)序，再根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，最后用該引物對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)做定性分析(Rassmannetal.，1991)。此方法工作量大，效率低。(2)微衛(wèi)星富集法，用含微衛(wèi)星序列的探針進(jìn)行雜交富集，構(gòu)建其富集文庫(kù)(Kandpaletal.，1994; Karagyozovetal.，1993)。這種方法操作較復(fù)雜，大量擴(kuò)增目的片段的同時(shí)，產(chǎn)生了大量的冗余序列(張?jiān)龃浜秃钕擦郑?004)。(3)搜索GenBank、EMBL 和 DDBJ 等公共數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得含SSR序列的方法，開發(fā)的微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性一般不是很高(段惠生等，2012)。近年來(lái)，由于錨定PCR技術(shù)簡(jiǎn)便、高效、多態(tài)性好，在微衛(wèi)星篩選中得到了廣泛應(yīng)用(盛良明等，2007；張俊鵬等，2012)。該方法是由Fisheretal.(1996)提出，用錨定簡(jiǎn)并微衛(wèi)星引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。此方法是一種分離微衛(wèi)星的簡(jiǎn)單、快捷的方法，避免了SSR富集的隨機(jī)性，具有明確的目的性和較強(qiáng)的富集能力，提高了微衛(wèi)星的分離效率，且通常每個(gè)序列都含有2個(gè)完整的微衛(wèi)星位點(diǎn)，開發(fā)效率極高(張?jiān)龃浜秃钕擦郑?004)。

目前，桃小食心蟲CarposinasasakiiMatsumura、桃蛀螟Conogethespunctiferalis(Guenée)、玉米螟Ostrinianubilalis(Hübner)、二點(diǎn)委夜蛾P(guān)roxenuslepigone(Moschler)、花薊馬Frankliniellaintonsa(Trybom)、黃胸薊馬Thripshamaiiensis(Morgan)、棕櫚薊馬ThripspalmiKarny、斑翅果蠅Drosophilasuzukii(Matsurmura)、稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusKuschel、扶桑綿粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsley等這些重要農(nóng)業(yè)害蟲的微衛(wèi)星位點(diǎn)尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)用錨定PCR技術(shù)對(duì)上述10種重要農(nóng)業(yè)害蟲進(jìn)行微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)篩選，并對(duì)微衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行分析比較，旨在探索該方法在農(nóng)業(yè)害蟲微衛(wèi)星DNA篩選中的有效性，為進(jìn)一步挖掘農(nóng)業(yè)害蟲的微衛(wèi)星位點(diǎn)及研究其種群遷移擴(kuò)散等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料及DNA提取

本研究中所用的物種均放于95%乙醇中，-20 ℃下保存?；蚪MDNA的提取方法參照Chuetal.(2005)，供試蟲體樣本數(shù)量均為1頭，提取的DNA放于-20 ℃下保存。

1. 2 錨定PCR擴(kuò)增

以提取的基因組DNA為PCR反應(yīng)的模板，使用根據(jù)需要設(shè)計(jì)的5′錨定簡(jiǎn)并引物NNNNNNNNKKVRVRV(CA)6進(jìn)行擴(kuò)增。建立50 μL反應(yīng)體系，體系中含有DNA模板3 μL、buffer 5 μL、dNTPs 1 μL、簡(jiǎn)并引物1 μL(10 μmol·L-1)、ddH2O 39. 5 μL、Taq酶0. 5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸2 min)，72 ℃再延伸7 min。

1. 3 克隆與測(cè)序

將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)切膠回收長(zhǎng)度500～750 bp的DNA，與PMD18-T連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂抹于含有氨芐西林(0. 1 mg·mL-1)的LB瓊脂平板上。挑取單菌落，放于含有氨芐西林(0. 1 mg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。取2 μL菌液，用通用引物M13對(duì)插入片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。13 μL反應(yīng)體系中含有菌液2 μL、buffer 1. 3 μL、dNTPs 0. 26 μL、M13通用引物0. 26 μL(10 μmol·L-1)、ddH2O 9. 3 μL、Taq酶0. 13 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性4 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸2 min)，72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選陽(yáng)性克隆。

1. 4 序列測(cè)定與分析

隨機(jī)選取片段大小為500～750 bp的50個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。利用Sequencher 5. 0 Demo軟件(http:∥www.genecodes.com/)去除冗余序列，再用SSR Hunter1. 3軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)的搜索，設(shè)置重復(fù)數(shù)至少為5，構(gòu)成重復(fù)元件的核苷酸數(shù)最多為6個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 簡(jiǎn)并引物的擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

用含有CA重復(fù)單元的5′錨定簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增10個(gè)物種的DNA，擴(kuò)增片段較彌散，多集中于200～2000 bp。經(jīng)PCR篩選，各個(gè)物種的克隆片段在500～750 bp之間。陽(yáng)性克隆率在10個(gè)物種中有較大的差異，最高為棕櫚薊馬(95. 8%)，最低為黃胸薊馬(20. 9%)，平均陽(yáng)性克隆率為57. 8%。10個(gè)物種的微衛(wèi)星比率在70. 8%～100%之間，最高為扶桑綿粉蚧(100%)，最低的是二點(diǎn)委夜蛾(70. 8%),微衛(wèi)星平均比率為91. 3%。克隆效率差異較大，最高為稻水象甲(88. 2%)，最低為黃胸薊馬(19. 9%)，克隆平均效率為52. 8%(表1)。

表1 微衛(wèi)星文庫(kù)的篩選結(jié)果Table 1 The screening result of microsatellite library

*陽(yáng)性克隆率指陽(yáng)性克隆占所有克隆的百分比；**微衛(wèi)星比率指含有微衛(wèi)星的克隆占所有陽(yáng)性克隆的百分比；***克隆效率指含有微衛(wèi)星的克隆占所有克隆的百分比。*Positive clone rate refers to the percentage of positive clones in all clones；**Microsatellite rate refers to the percentage of microsatellites identified in all positive clones；***Cloning efficiency refers to the percentage of microsatellites identified in all clones.

2. 2 微衛(wèi)星類型

去除重復(fù)序列后進(jìn)行微衛(wèi)星搜索和分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，冗余率(重復(fù)序列的數(shù)量/總序列的數(shù)量)在不同物種間差異較大，最低為棕櫚薊馬(2. 3%)，最高為扶桑綿粉蚧(71. 7%)(圖1)。各個(gè)物種平均每條序列含微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)為1. 9～2. 4，桃小食心蟲、扶桑綿粉蚧和稻水象甲的平均位點(diǎn)數(shù)小于2，其他物種均大于2。

從微衛(wèi)星位點(diǎn)(核苷酸堿基組成)分布類型的角度分析，除簡(jiǎn)并引物中所含有的CA/TG重復(fù)序列外，還發(fā)現(xiàn)其他類型的重復(fù)序列，如：二核苷酸AT、GC、CT/AG等3種重復(fù)單元；三核苷酸AAC、GGT、GCA、GCC、TCC等10種重復(fù)單元；四核苷酸TCGC、GACA、GTGC、ATCT、TGTC等5種重復(fù)單元。不同物種以二核苷酸CA/TG重復(fù)序列數(shù)目最多，在89. 2%～100%之間，二核苷酸(CT/AG、AT、GC)、三核苷酸和四核苷酸所占比例較低。其中，花薊馬、扶桑綿粉蚧和稻水象甲二核苷酸的比例為100%，扶桑綿粉蚧的CA/TG重復(fù)為100%(表2)。從微衛(wèi)星位點(diǎn)(重復(fù)次數(shù))分布類型的角度分析，10個(gè)物種中，具有最高重復(fù)次數(shù)的是玉米螟，達(dá)39次，其最低重復(fù)次數(shù)為5(SSR hunter的最低重復(fù)次數(shù)設(shè)置為5次)。大部分物種的SSR序列較短，如桃小食心蟲的SSR片段長(zhǎng)度為10～36 bp，玉米螟的SSR片段長(zhǎng)度為10～78 bp。各個(gè)物種的平均重復(fù)次數(shù)為6. 7～8. 9次(圖2)。

根據(jù)Weber(1990)的微衛(wèi)星分類標(biāo)準(zhǔn)，本研究中涉及的10個(gè)物種的微衛(wèi)星類型90%以上都是完全型，不完全型和復(fù)合型的SSR所占比例較少。不完全型的微衛(wèi)星比率最高的物種為玉米螟(5. 7%)，復(fù)合型的微衛(wèi)星比率最高的物種為桃小食心蟲(5. 0%)。其中，扶桑綿粉蚧和桃蛀螟的微衛(wèi)星類型均為完全型(圖3)。

圖1 序列冗余率分布

表2 微衛(wèi)星位點(diǎn)類型分布(基于核苷酸堿基數(shù)目)Table 2 Distribution of microsatellite types (based on nucleotide numbers)

*包括重復(fù)單位CTG、GCA、GCC、TCC、GAA、AGA、TTA、TCC、AAC、CCA;**包括重復(fù)單位TGTC、GTGC、ATCT、TCTG、GACA。*including the repeat unit as follows: CTG, GCA, GCC, TCC, GAA, AGA, TTA, TCC, AAC, CCA;**including the repeat unit as follows: TGTC, GTGC, ATCT, TCTG, GACA.

3 討論

本研究表明，10個(gè)物種中陽(yáng)性克隆率最高為95. 8%，平均陽(yáng)性克隆率為57. 8%，高于通過(guò)探針雜交法獲得的陽(yáng)性克隆率(安建東等，2011；郝卓然等，2012;吉亞杰和張德興，2004)。本研究中，微衛(wèi)星比率最高為100%，微衛(wèi)星平均比率為91. 3%，高于通過(guò)探針雜交法獲得的微衛(wèi)星比率(程月琴等，2013;張國(guó)彥和翟保平，2008)。盛良明等(2007)利用錨定PCR技術(shù)測(cè)定結(jié)果表明，陽(yáng)性克隆率和微衛(wèi)星比率均達(dá)到了100%；張俊鵬等(2012)也證明利用該技術(shù)篩選的微衛(wèi)星比率極高，達(dá)97. 7%。徐波等(2012)對(duì)使用磁珠富集法與錨定PCR法開發(fā)背瘤麗蚌Lamprotulaleai(Gray)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)錨定PCR技術(shù)獲得的陽(yáng)性克隆比率高。此外，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)10個(gè)物種的冗余率(2. 3%～71. 7%)、假陽(yáng)性率(0～29. 2%)之間差異較大。

圖2 微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)分布圖Fig.2 Distribution of repeat number of microsatellite in the species analysed CN=Carposina nipponensis, CP=Conogethes punctiferalis, ON=Ostrinianubilalis, PL=Proxenus lepigone, FI=Frankliniella intonsa, TH=Thrips hawaiiensis, TP=Thrips palmi, DS=Drosophila suzukii, LO=Lissorhoptrus oryzophilus, PS=Phenacoccus solenopsis.

圖3 微衛(wèi)星類型分布[基于Weber(1990)標(biāo)準(zhǔn)]

在所有動(dòng)物基因組中，(CA)n微衛(wèi)星的含量最為豐富(Brenneretal.,1993)。因此，本研究使用(CA)n簡(jiǎn)并引物來(lái)研究10個(gè)物種，以獲得更多的微衛(wèi)星位點(diǎn)。本試驗(yàn)中，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重復(fù)單元在鱗翅目、纓翅目、雙翅目、同翅目和鞘翅目中差異不明顯，二核苷酸在不同目間的比例為95. 1%～100%，三核苷酸的比例為0～4. 9%，四核甘酸為0～1. 73%，較高的二核苷酸比例可能與錨定引物篩選方法有關(guān)。

本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的錨定簡(jiǎn)并引物中含有6個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)，測(cè)序結(jié)果表明，獲得的克隆兩端大部分至少含有6個(gè)二核苷酸重復(fù)，并且每條序列大部分都含有2個(gè)以上的微衛(wèi)星位點(diǎn)，說(shuō)明錨定簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增可以有效獲得微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)。本試驗(yàn)中分離的微衛(wèi)星的平均重復(fù)數(shù)為6. 35～7. 50次，最高重復(fù)次數(shù)為34次。馬麗華(2008)通過(guò)該方法獲得的微衛(wèi)星的平均重復(fù)數(shù)為7. 19次。而通過(guò)磁珠富集法獲得的微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)大部分都在10次以上(安建東等，2011；連灝等，2012)。這些結(jié)果表明,錨定PCR技術(shù)獲得的微衛(wèi)星重復(fù)數(shù)低于磁珠富集法(馬麗華，2008；徐波等，2012)。

Weber(1990)按照微衛(wèi)星核心序列的不同將微衛(wèi)星分為3種類型：完全型(perfect)、不完全型(imperfect)和復(fù)合型(compound)。本試驗(yàn)中,10個(gè)物種的微衛(wèi)星類型90%以上都是完全型，不完全型和復(fù)合型的微衛(wèi)星DNA所占比例較小。完全型微衛(wèi)星DNA是動(dòng)物基因組中比例最大的結(jié)構(gòu)類型，而不完全型和復(fù)合型微衛(wèi)星比例的高低在不同物種中存在差異(連灝等，2012；馬雅軍等，2008；王蕾等，2009；張麗等，2009)。

分子遺傳標(biāo)記是近來(lái)現(xiàn)代遺傳標(biāo)記學(xué)發(fā)展較快的領(lǐng)域之一，微衛(wèi)星則被認(rèn)為是各類分子遺傳標(biāo)記中最有價(jià)值的一種。隨著生物統(tǒng)計(jì)學(xué)研究的不斷深入，微衛(wèi)星在度量品種遺傳多樣性、估測(cè)品種間遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹等研究中顯示出巨大優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用前景非常廣闊(徐興莉和楊虎，2011)。本研究采用5′錨定PCR技術(shù)大大降低了研究成本,提高了篩選效率，是從物種基因組中分離微衛(wèi)星位點(diǎn)的一個(gè)較好策略。

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